Re: [問題] RT-PCR怎嚜沒有出現band>"<

看板Biotech (生命科學)作者miRNA (miRNA)時間19年前 (2006/07/15 10:23)推噓3(3推 0噓 0→)

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※ 引述《tsen (做實驗做到快窒息@.@)》之銘言： : 我使用的primer是在405bp的位置 : 但是跑完膠之後用UV照射後卻不見band出現 : 我同時間訂了三對primer其他兩對都做的出來 : 唯獨這對很奇怪 : po一下這對primer的資料 : Primer F：35mer, GC content：51%, Tm為66.8度 : Primer R：26mer, GC content：54%, Tm為61.1度 : 跑完之後是連雜band都沒有好歹也出現個雜band阿 : 完全沒有東西讓人沒有頭緒阿況且其他兩對都做的出來阿 : 會是primer F太長了嘛? : 麻煩各位大師幫我看一下阿>"< 感謝!!! =====>if 去除掉太一般的技術問題, ex: 某管PCR漏加dNTP, primer漏加一根... (這些都要請原po注意到) 預測的PCR product size是405 bp, 應該不會有做不出來的問題真的如你所言, 同樣的cDNA(我指一模一樣的同一批, 同一管)大家都做的出來, 只有這組primer做不出來的話.... 如果問題在primer上最可能情況有如下二種: 1. 請check一下primer sequence的最後一個mer, 是不剛好在那個gene的SNP處個人經驗是primer 的最後一個nt如果mismatch, 是不可能做得出來的上NCBI database查一下吧 2. 沒看到你的primer sequence, 我不知道你這組primer 是不是self-dimer太嚴重, if so, 降annealing temp不一定做得出來個人建議於PCR mixture中加入DMSO, 幫忙把2級結構打開記得DMSO conc. <5% 如果問題在cDNA上要注意那個gene是inducible or constitutive expression?? 是不是induce得不好?? check一下藥過期了沒呼... 我還是去做實驗好了, 打字手真酸... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 59.112.90.52