Re: SDS PAGE 問題
※ 引述《boblu (六百)》之銘言：
> 一個跑sds page 有時會碰到的問題
> 以前都不是很在意 反正有時候碰到有時候不會 且 western 能染出要的東西就好了
> 但最近需要高品質的PAGE結果
> 而我花大精神做的 sample 卻每每死在 SDS PAGE 這裡 感覺很... :(
> 我碰到的狀況是 一條 lane 在某個很強的 band 的位置變成"微笑"狀
> 微笑上面的 band 都很清楚 下面的就胡掉了
> 而且微笑的那個位置 整條 lane 的寬度會收縮
> 如果旁邊有 maker 會很明顯看到 marker 的寬度在同樣的位置開始擴張
> 基本的想法是鹽類太高或蛋白質濃度太高
> 但我這次碰到問題的樣品是純化出的蛋白質 也置換過 buffer
> 鹽類跟蛋白質濃度還有 pH 都還算一般
> 晚一點貼個圖給大家看
圖貼上了
http://photo.pchome.com.tw/boblupersonal/019/
左邊是原始影像 右邊是處理過的影像 箭頭是我想要取得的蛋白質
共有五條 lane 分別是 sample1 marker sample2 marker sample3
sample1 2 3 其實是一樣的東西 是我試圖純化的蛋白質
溶在 protein A/G column 純化抗體時用的 elute buffer + neutrolyze buffer
（我是作了一個 antibody column 來純化蛋白質）
用 10kD 的 ultra filter unit 去鹽並濃縮
估計蛋白質濃縮五倍 buffer dilute 到 1/5
跑 7.5% 的 sds page
staking 50V 15 min
seperating 200V 跑到底(~40min)
然後 50V 100min transfer 到 membrane 上 染 coomassie blue
目的是要拿去作 N-terminal sequence
sample 3 的 loading 量是 1 2 的1/5
看起來 loading 少是比較漂亮 可是
1. 總覺得沒什的道理 濃縮的 sample 裡面明明什麼東西都還是很少
2. loading 少 想看到的 band 就找不到了
3. 分子量大概五十以下還是很模糊
PS. 我做過好幾次 只有一次跑出漂亮的結果 那次用的是10%的sds page
可是這種濃度下 我想要的蛋白質附近其他的 band 又分不太開
--
莫非定律:
到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上
補充定律:
拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考
--
※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw>
◆ From: ym71010.ym.edu.tw
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