[問題] 我的insert切不下來
不好意思，請高手幫幫我
1.就是我的目標基因 （insert，約400bp），接上T-A Vector，
送入E .coil中transform放大之後，
無法從T-A Vector 上切下來，
就無法把insert送去構築在我所想構築的另一個Vector上。
我是這樣做的：
有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ
↓
用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ
↓
做失活（80度，20min）
沈澱（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH）
55度dry乾，溶ddH2O 23λ
↓
用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下補到total:30λ
↓
做失活（80度，20min）
↓
跑gel 2λ (argarose，1%)
只出現一條>2000bp的band(因為我只用100bp maker)
並沒有400bp的band
註
T-A vector : 2728bp
我想請問：
1.為什麼我的insert切不下來？
我用Sma I 、BanHI的時間都有加長 大約一倍了
也做了失活
需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊
T-A vector上也確實有Sma I 、BanHI的切位
我的inesrt也確定有接在T-A vector上（送過定序）
我該如何處理？該改進什麼地方？
我在酵素的海報（我忘記哪間公司，好像是NETBIO）
對照時發現Sma I 、BanHI交叉點是「連續切位」
請問這是什麼意思？
會造成digestion失敗嗎？
2.若之後順利切下後
構築時（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？
該注意些什麼技巧？
專題作不出來
推徵眼看就要到
懇請善心人士幫我一下
感恩～～鞠躬～～～
--
當人們開始盤算的時候
上天就笑了
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.131.222.191
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