Re: [問題] 我的insert切不下來

看板Biotech (生命科學)作者s73121 (ok)時間19年前 (2006/08/25 09:17)推噓1(1推 0噓 2→)

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※ 引述《melodyrabbit (melody)》之銘言： : ※ 引述《CloudTear (照片能吃嗎？口去～)》之銘言： : : 不好意思，請高手幫幫我 : : 1.就是我的目標基因（insert，約400bp），接上T-A Vector， : : 送入E .coil中transform放大之後， : : 無法從T-A Vector 上切下來， : : 就無法把insert送去構築在我所想構築的另一個Vector上。 : : 我是這樣做的： : : 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ : : ↓ : 你的DNA濃度呢? : 只取10ul的話,很可能它是有切下來的,只是切出來的band太淡了看不到 : 而且之後去ligation的話insert也需要多一點阿 : : 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ : : ↓ : : 做失活（80度，20min） : : 沈澱（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） : : 55度dry乾，溶ddH2O 23λ : : ↓ : : 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下補到total:30λ : : ↓ : : 做失活（80度，20min） : : ↓ : : 跑gel 2λ (argarose，1%) : : 只出現一條>2000bp的band(因為我只用100bp maker) : : 並沒有400bp的band : 確定你的enzyme buffer有用對嗎? : 定序後切點的位置有突變嗎? : : 註 : : T-A vector : 2728bp : : 我想請問： : : 1.為什麼我的insert切不下來？ : : 我用Sma I 、BanHI的時間都有加長大約一倍了 : : 也做了失活 : : 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 : : T-A vector上也確實有Sma I 、BanHI的切位 : : 我的inesrt也確定有接在T-A vector上（送過定序） : : 我該如何處理？該改進什麼地方？ : : 我在酵素的海報（我忘記哪間公司，好像是NETBIO） : : 對照時發現Sma I 、BanHI交叉點是「連續切位」 : : 請問這是什麼意思？ : : 會造成digestion失敗嗎？ : 意思就是這兩種酵素的作用溫度不同,buffer也不同,所以不能同時切 : 要切完一刀再切另一刀的意思 : 你做的方法就沒錯啦 : : 2.若之後順利切下後 : : 構築時（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ : : 該注意些什麼技巧？ : : 專題作不出來 : : 推徵眼看就要到 : : 懇請善心人士幫我一下 : : 感恩～～鞠躬～～～ 400bp跑完膠可能會太淡看不太到..再加上你經過phenol/chloroform純化一定會lost一些..所以建議你digest完直接跑膠.. 若要確定enzyme是否有作用可以分別做single digestion 跑完膠看size就知道是否有切動了. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.91.19