Re: [問題] 有關western blotting的問題

看板Biotech (生命科學)作者wahahaccc (jolly)時間19年前 (2006/09/27 19:14)推噓1(1推 0噓 2→)

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※ 引述《lotany.bbs@127.0.0.1 (可愛女孩)》之銘言： : ※ 引述《wahahaccc.bbs@ptt.cc (jolly)》之銘言： : : 在下最近進行westerm的實驗 : : 想要看的蛋白是cytochrome c (15kDA) : : 算是小分子的物質 : : 因此就製作15% GEL進行實驗 : : 可是最後壓片出來的Band很粗不是細細的一條 : : 而將同樣15%gel去看 actin(43kDA)結果的BAND 就是細的一條 : : 撇除cytochrome c量表現很多因為跑12.5% Gel時 band就不會很粗 : : 請問各位也有這樣情況嗎或是這是要怎麼解釋啊 : : 感恩 : 這跟gel的%有關係當跑15%的時候小分子區域的位置就會被拉開 : 因此就會造成Band 很粗 : 而大分子區域沒辦法將距離拉這麼大 : 所以會被壓縮成一條細細的band : 不過我比較想問W大 transfer的condition : 因為我最近也要壓小分子蛋白但是壓不出來 : 可以請問一下 transfer buffer的配方跟transfer時的condition 嗎 : 謝謝^^ 首先謝謝你的解答我用的 Transfer buffer: 10X Tris-Glycine (0.25M Tris base : 3.03g + 2M Glycine : 15.01g /100 ml)→100ml ddH2O→700ml Absolute methanol→200ml Adjust pH to 8~8.3 Keep at 4oC before use Transfer 定電壓 30V overnight 電流約90mA 可是說實在的因為BAND有點粗並且每各WELL的BAND沒有一樣粗壓片結果表現明顯的BAND又黑又粗不明顯的就較淡也較細老闆不滿意覺得不漂亮所以後來我又換回12.5%GEL 而另外學弟舉一反三配製了13.5%GEL 想說解決12.5%GEL 擔心小分子的跳海 15%GEL BAND的不漂亮結果還不錯你可以試試以上是我的經驗希望對你有幫助等你進行完了之後可以分享你的感覺嗎讓我參考一下感恩 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.94.127