Re: [問題] confocal樣本處理

看板Biotech (生命科學)作者yoyomi (追求飛翔)時間19年前 (2006/12/15 19:01)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《fjubiology (Science閱讀俱樂部)》之銘言： : ※ 引述《paua (waiting for good news)》之銘言： : : 我染PI出現兩個問題, : : 麻煩請幫我看圖中紅色的部分, 謝謝 ^^ : : 這是以前染的fibroblast, 是成功的 http://tinyurl.com/y9jpnb : : 問題一相同種類細胞, 但是染到細胞質, 且核部分不明顯 http://tinyurl.com/ygtgfb : 有可能是染劑未完全進入標地位置以及未沖洗乾淨(撇開您細胞質紅色影像為其他抗 : 體之紅色螢光)。此張影像似乎有過飽和的感覺(背景都是綠的，理論上應該是黑色) : 建議： : 染完後用PBS多洗幾次，此外PI是鑲嵌於DNA雙股中。另外細胞質內有mitochondria : ，其也含DNA，PI也會染到(一隻mitochondria有百個DNA copy) : : 問題二不同種細胞(keratinocyte), 為什麼核中有圓圓區域染不到 : : keratinocyte A: http://tinyurl.com/yc6g5g : : keratinocyte B: http://tinyurl.com/ycdpt8 : : 是因為不同種類細胞而有的特徵嗎? : : 可是我實在想不出來那應該是細胞核的哪一個細部位置? 有些人說是核仁, : : 但核仁的顏色應該要比較深(紅), 不是嗎? : 染有DNA的地方。你AB兩張拍到的是正常情況下confocal MS看到的PI結果 : 造成你問題一與二PI染色的結果不同，除了上述之外還有可能是機器操作的問題 : 雷射強度過強造成訊號過度飽和，pinhole開太大，雜訊過多都會造成細胞核染PI後一 : 團紅。依本人多年操作confocal MS經驗只有細胞核皺縮才會染到一團紅紅的。 : 改善實驗建議： : 使用confocal MS 時pinhole盡量小，雷射強度也是。若訊號過低時建議先稍稍調高雷射 : 視結果再調pinhole。相信萊卡，蔡斯，bio-rad等品牌都有影像重複疊合最佳化的介面 : (kalman等方式)，利用短時間重複掃描計算得到最佳影像。 : : 我處理步驟都一樣(每個步驟之間都用PBS wash三次): : : 1. 細胞固定: 2% paraformaldehyde, 15min, RT : : 2. 打洞: 0.1% triton X-100, 10min, RT : : 3. blocking: 1% FBS in PBS 1-2hr, RT : : 4. 染一抗: 這部分沒有問題, 暫不討論 : : 5. 染二抗: 同上 : : 6. 染核 PI: 4ug/mL, 5min, RT : : 7. 封片 : 一個曾經以玩confocal MS為興趣的過來人我幫你看過你的DATA了以第二張為主作討論請直接換掉原來使用的PI 重新泡過新的..(新鮮很重要) 再重新試試看... 另外 PI染完要記得也要用PBS wash3次大概是這樣因為第一張圖的確是成功的代表手法沒問題 confocal也沒問題再來不同的細胞的確染出來的PI效果會不一樣基本上你的keratinocytes圖算是合理的如果你希望連裡面的核仁都染到的話改變打洞時間和染PI時間應該會有點改善 confocal的強度亮度基本上是OK的但是以P大所說的第二張圖的背景的確過量可以以P大的方式來改善背景問題我曾經是confocal操作員學生常有像你一樣的問題所以大致照上面情形改善吧如果仍然有問題再詳細點說明你的情況囉... 加油加油... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97