[問題] 想請教關於Inclusion body純化的問題

看板Biotech (生命科學)作者Fourfish (～四條魚～)時間19年前 (2007/01/04 00:02)推噓4(4推 0噓 2→)

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唔...我的實驗現在卡在蛋白質的expression和純化已經有一段時間了... 我先說明一下現在實驗的狀況跟目的好了.... 希望有前輩能指點我過程是否有問題我的實驗是要將表現某蛋白質的基因transformation到E.coli 利用E.coli表現蛋白質並純化此蛋白質作為疫苗使用蛋白質大小約48kD 表現載體為Promega的pGEMEX 利用T7 polymerase進行表現 E.coli strain 是BL21(DE3）...如果學長沒說錯的話... Induce 3hr後收菌液離心接著PBS重新懸浮後用超音波破菌離心收上清液和沈澱跑SDS-PAGE後確定了我的蛋白質在沈澱中（inclusion body）基本上到這裡應該沒甚麼問題... 因為我的蛋白質是單純要打老鼠用的暫不在乎蛋白質的folding正確與否另外我希望能純化出多量且較純的蛋白質所以我想直接純化inclusion body來得到我的蛋白質我在網路上收集一些純化inclusion body的方法（都找到wash的方法..）最後我用wash的方法作純化 buffer成份為： buffer1：0.5% Triton X100; 50mM Tris-HCl pH8; 100mM NaCl; 0.1% sodium azide buffer2：成份一樣僅不含triton X100 步驟為：以buffer1再懸浮清洗pellet，離心18000Xg，20min，4度C 重複四次再以buffer2洗過以去除triton X100，離心後保存pellet 原步驟最後會用8M Urea去溶pellet 可是當我這樣作之後SDS-PAGE跑出來結果非常的醜...而且根本不能判斷結果... 所以我只用PBS沖起pellet就拿去跑SDS-PAGE （有99度煮過）現在問題來咧.... SDS-PAGE的結果我要的蛋白質的確還在且明顯的除掉了其他的proteins 但是...gel上卻有兩條bands 大小相近...我以7.5%的gel要跑到最底才分的明顯... 估計應該46kD左右吧... 另外濃度都還蠻相近的（從染色上看來...）我想了解另一條蛋白質是甚麼、會不會影響實驗才知能否利用這些純化出來的蛋白質... 所以...一條是我的...另外一條約46kD左右...會是甚麼呢？@@ 會是E.coli的蛋白質嗎？還是我的蛋白質folding的問題？？不過跑SDS-PAGE煮過應該不至於吧...?? 另外我考慮到的是vector的關係嗎？還是整個純化步驟少了些甚麼...？希望有經驗或了解inclusion body純化的人能指點我><" 或者可以提供其他純化的potocol讓我參考（wash或surcose gredient超高速離心法都可）希望可以幫幫我!!如需要補充其他流程或狀況的我會在補充在此先感謝了!! -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.64.93.103