Re: [問題] 關於cloning

看板Biotech (生命科學)作者werthers6925 (...)時間19年前 (2007/02/13 13:00)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《Adler (Adler)》之銘言： : 我想要將一段只有50初b.p.的tag : 接到一個約5kb的vector上 : 想要請問一下有沒有人做過類似的實驗 : 可以告訴我insert與vector間的molar ratio大概是多少 : 我已經試過許多比例了...@@ : 謝謝大家請問...你是做不出來? 還是在做之前先問清楚比例?? 我之前有做過類似的clone 我是將一段linker(約40bp)接到plasmid上, 並且是oligo合成之後用RE切老實說, vector和insert的比例根本不重要.... 只要把握一個要點....insert的分子數>>vector的分子數就行了如果你一直做不出來...我就根據我的經驗幫你作推測.... 你說你的insert已經在TA vector上了...然後用RE切完跑完GEL可以看到band 所以...RE的作用很好.... 因此...問題出在你從GEL中純化出DNA這各步驟由於你的insert只有50bp...非常小你的insert跑完gel後...接下來的步驟就是切下gel... 加上你要用來純化DNA Kit的buffer....然後放到65度C將gel溶解問題就出在65度C煮的過程..... 因為你的insert只有50bp...在65度C的環境中...他有可能會部份denature... (想像一下PCR的原理, 應該很容易了解) 我之前做這各類似的CLONE一直做不出來的原因就是在此... 因此, 改良的作法是..... 當你加入BUFFER時....請不要放到65度C去煮你的GEL.... 請在室溫下....不斷拍打你的tube (一般而言, gel + buffer in 65度C環境....大約5分鐘左右會將gel溶解.... 在室溫下....約要30~60分鐘) 在室溫下溶解你的gel...可以確保你的DNA部會denature.... 等到gel溶解後...就照一般程序去純化你的insert.... 然後做ligation..... 至於比例....不用太在意....只要你insert夠多就行了..... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.54.2