Re: [問題] subculture後,cell在dish上分布不均勻
我們也會利用pipet打散細胞
trypsin切下後細胞並不見得會呈現"個體"狀態
trypsin可能是把細胞"整片"切下
所以要再用pipet"儘量"讓它們完全均勻分佈在medium中
但跟各位前輩不同的地方是, 我們沒有再離心去廢液
這目的是...?!
在較大的dish中比較不會發生細胞分佈不均的情況
通常只會在較小的well中發現
但保險起見
我們會先知道該細胞完全貼附的時間(我們的約30分@@a)
在這時間內會偶爾去給它搖個幾下(約隔10分鐘左右吧)
搖的方法也儘量避免讓它的液面呈漩渦狀轉動
可以左右各讓它傾斜幾秒鐘, 再前後幾秒鐘
這樣子~我們家的細胞老大都還滿聽話的
也很少看到有"聚賭"的情形= =|||
以上參考~~
※ 引述《studyno1 (汲取知識)》之銘言：
: ※ 引述《boyo (29大頭)》之銘言：
: : MEF是mouse embryonic fibroblast吧
: : 你的作法是不是漏了一步??
: : MEF大部分的用途是用作ES cell的feeder
: : 所以MEF貼dish貼平均非常重要 貼不平均你的ES cell就很容易分化
: : 你加medium的用途是要inactivate trypsin的作用
: : 加完後要用pipet把dish上的細胞沖乾淨
: : 再吸到15cc tube "pipet幾次 打散細胞" <--你是不是少這步驟
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^請問這步驟是specific for MEF 嗎?
: 從大學到碩班 老師學長姐教subculture都沒有這個步驟耶
: 都是加完trypsin-EDTA後RT靜待一下(或放incubator一會兒) 然後輕拍dish
: 或是直接用pipet把細胞沖下來 收集細胞液到離心管就直接離心了耶
: 我只有這個步驟不太一樣 其他都相同
: 加了這步驟的目的是什麼?
: : 打散完後再去離心 算準要passage多少細胞後
: : 吸去廢液 再加medium去pipet打散pallet
: : trypsin-EDTA的作用是只是化學性的 你也要加一些物理性的作用
: : 就是用手打散細胞
: : 十字搖勻的 看你的步驟應該沒問題 不過記得搖的時候
: : 前後搖完 要等液面不再晃動再左右搖 不然細胞都在原地散步
: : 有問題再問吧
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