Re: [請益]請問如何表達toxic protein在BL21(DE3)ꤠ…
※ 引述《qumai (._.)》之銘言：
: 借用一下文章
: 剛好也有這樣的問題^^a
: : 先養到1L, (e.g. M9) OD>1.0 (2g α-D-Glucose/Glc)
: 請問是一開始就加入2g α-D-Glucose/Glc
: 然後養到OD>1.0嗎
Yes.
嗯。但實際上在inoculate的過程中，可以測試最大 OD_600nm.
像以正常的 x mL LB->20/50mL M9->1L M9，這個20 or 50mL
就可以大概知道這次的medium and colony可以長到最多多少，
當然這會讓你slightly over-grown，不過基本上看到OD掉了，
就立刻換1L應該影響不大。
以BL21(DE3)pLysS來說，用glycerol stock勉強可以，但仍以
fresh transformation最佳。測試條件如果是表現問題，應該
用最高品質來試比較容易抓到條件。
我在用的M9（網路上有很多版本）
1. Na2HPO4(anhydrous) 67.8g (10x M9)
2. KH2PO4 30g
3. NaCl 5g
4. 調整pH，如果是要用isotope NH4Cl的話，否則可以和NH4Cl一起調到pH7.4
至於5x or 10x都可以，但都會有不等的沈澱，對我的系統來說並不影響結果。
如果你不放心，那就每次都新配→autoclave.
5. Glc=4g (2g+2g), 全部都是先配Glc=2g, 只有最後要加 IPTG才把剩下的2g
加給菌吃。
過程就是→
xmL LB OD_600nm =0.5~3.0/OD here should be OK (not critical), (spin down)
20/50mL M9 OD_600nm~OD_max (spin down or not for lazy people like me)
1L M9 reaching OD_max
->add more Glc and IPTG at the same time.
這種作法的缺點是：菌一定要耐得了overgrown, 而且菌的品質要好，
再來OD_max不一定是induce的最佳條件。
不過因為表現出來的蛋白可能有毒，所以就以最大菌數來撐蛋白產量，
表現到菌死掉那就無所謂了。
因此，如果你的蛋白要養到>10小時才會出來，那就可能不適合這樣作。
好處…好處就是菌會等你…因為沒東西吃了。熟了之後你也不必管OD的問題…
: : 然後再加IPTG(or 或用來induce的藥品）以及另外2g Glc.(if using
: : stock solution, then it's 10mL 20% (w/v) Glc)
: : Let me know, thanks!
: 我目前嘗試在前面加上signal peptide
: 還是看不到有表現orz
: 而且..BL21(DE3)本身
: 會有兩個蠻粗的band在18.4及25 kDa的地方
: 很容易誤會是overexpression的產物 囧
PAGE? 這技術還是需要有一點時間去找到染色、退染的最好時間和ETOH/MEOH
的比率的，over-destain的話，好不容易表現出來的蛋白就看不到了。
當然染不起來也可能是蛋白本身的問題，那麼就要破掉1L的菌純化才會知道是
不是染不到蛋白的問題了。
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◆ From: 76.204.102.39
※ 編輯: Ren 來自: 76.204.102.39 (08/16 08:52)
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