Re: [問題] 使用Urea deaggregation後回收率?

看板Biotech (生命科學)作者aggaci (下棋吧 five chess)時間18年前 (2007/08/29 13:37)推噓6(6推 0噓 11→)

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※ 引述《ronall (暱稱小公主的!扣十分先)》之銘言： : 抱歉 : 小弟又來請教各位了 : 小弟純化蛋白後 : 發現蛋白有aggregation的現象 : 我擔心這會影響我的蛋白產率 : 所以想使用Urea去deaggregation : 之後想使用透析的方式除去Urea : 我想問的是 : refolding回來且為正確結構的蛋白能有多少? : 因為我有問過我家的博士後 : 他跟我說別將urea處理後的蛋白混在正常結構的蛋白中 : 他認為refolding的結構不確定正確與否 : 必須經由CD去鑑定 : 不知各位有什麼樣的想法呢? 通常會加一些chemical chaperon去幫助folding 如glycerol，我記得古早的PNAS有針對這一點發了一篇article refoldingㄧ定會有一些沉澱，沉澱可能是folding錯誤所造成但是soluble的部份也不全然是folding正確的 (denature通常是會打斷雙硫鍵和氫鍵，若是ㄧ個蛋白質可以形成4個雙硫鍵，排列組合一下你就知道有多少種組合) 所以這時就去測它的活性，或是用以之特性去證實 (如A和B可以結合，那就用IP的方法去證實) 當然少部分人是用CD去看，CD只看二級結構，所以不全然可信與其一直卡在這裡，我覺得就先確定是否有活性有的話就直接往下做了，別去管裡頭有多少比例是"正確的"protein : ==========================細節說明討論發起線================================== : 先感謝各位大大的回應 : 包含前面用水球丟了我好幾次的大大 : 我想就我的想法說明好了 : 確實 : 當"產量"夠的時候 : (產量定義為足夠我進行實驗的用量) : 我確實是不需在乎aggregation的部分 : 但是當我產量不夠的時候 : 我必須額外再生產一批 : (不含等待的純工作天約14天) : 因此小弟在評估從沉澱中將aggregation作denature並使其refolding : 這樣的方式在時間上以及程序上是否比較有利? : 然 : 我的實驗室並沒有人做過這樣的實驗 : 我想問的是 : 博士後認為我必須將urea處理的沉澱 : 與上清液的正常蛋白分開處理 : 因為他覺得refolding miss的機會很大 : 所以認為我必須分開處理後再以CD或其他方式去鑑定結構很正確 : 但我認為 : 我知道refolding miss的機會存在 : 但也不能否定正常foding蛋白的存在 : 同時 : 我實驗用的蛋白其Apo-,Holo-兩種構型僅有些許不同 : PI值分別為3.2, 3.3 : PI值差距這麼小的情況下能夠以Q-sepharose分離 : 那麼 : folding miss的蛋白我認為應該也能夠被分離 : 既然能被分離 : 那為何我還必須獨立處理這個部分呢? : 這個部分是我最想知道的 : 感謝各位囉^_^ 你的意思是不分離沉澱的部份嗎？ -- http://www.wretch.cc/album/aggaci -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.100.165

推

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