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[求救] 有關cloning的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (Je t'aime)時間18年前 (2008/03/14 00:56), 編輯推噓8(8推 0噓 12→)
留言20則, 7人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
最近在做cloning 所要insert進去的片段大概是1700 bp 所使用的是p-GEMT easy vector 前面都很順利 後來挑了white colony 抽plasmid後 用PCR做confirm(老闆說這樣比較省錢) 結果出來 完全沒有insert 初步排除是X-Gal出問題 因為有藍有白還蠻多的 而其他inser進去的片段是400 bp的都成功 唯獨這個大片段的 挑了快20個white colony都沒有insert進去 有沒有人遇到這樣的情形 拜託幫幫忙 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 192.192.90.48
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03/14 01:44, , 1F
再多挑一些看看吧
03/14 01:44, 1F
推
03/14 08:44, , 2F
這套我用過也做過2k左右的insert..有一些小訣竅
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03/14 08:44, , 3F
例如放到4度冰箱冰一個小時加強表現
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或是可以延長一點ligation的時間
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還有挑的時候可以再拿更多colony..反正是跑PCR
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看看那精美的96孔盤...你知道我的意思吧
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推
03/14 09:46, , 7F
為何不直接作coloy PCR? 另外 ligation放室溫 o/n 試試
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03/14 09:48, , 8F
另外 樓上說的對,一次挑 就挑96個,多挑個幾盤總會有一兩個!
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推
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樓上沒說我還沒發現他是抽plasmid做PCR..
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03/14 10:01, , 10F
做colony PCR就好了..比較方便
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推
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有做 PCR positive control 嗎?
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03/14 12:08, , 12F
已經有放在冰箱快3小時了~藍白還蠻明顯的~
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03/14 12:08, , 13F
沒有做positive control 不過其他盤都是有出現insert成功
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03/14 12:09, , 14F
大家都建議挑多一點 可是今天又再挑了快12個 還是沒有~
03/14 12:09, 14F
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老闆說這樣太不划算了 要看看問題在哪再做 實在很苦惱
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推
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換一個抗生素~~~
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推
03/14 18:04, , 17F
Clone 到別的 plasmid 試試....不一定要用 pGemT
03/14 18:04, 17F
推
03/14 20:47, , 18F
挑12個就要有對的要蠻運氣地~
03/14 20:47, 18F
推
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怎麼會不划算呢..不要抽plasmid做colony PCR
03/15 07:46, 19F
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03/15 07:47, , 20F
不用半天就能screen上百個colony..快又方便XD
03/15 07:47, 20F
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