Re: [求救] TA cloning一直失敗.....

看板Biotech (生命科學)作者puec2 (^^y)時間18年前 (2008/06/12 21:23)推噓3(3推 0噓 0→)

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※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言： : 我用的是invitrogen的TOPO TA Cloning : 用Tag P出我的要的片段,約1800b.p : 加4ul和1ul的salt solution及1ul的TA vector作用 : (22度西 30分鐘) : 接著用自己做的competent cell(DH5α)做CaCl2 transformation : 結果做了快10盤,不是沒長,就是長的colony抽不出質體 : (養的時候感覺菌液就不是很正常,有點稀) : 抗生素Ampicillin及Kanamycin都用過了 : 不知道有沒有人可以給我個建議,麻煩大家了 : 謝謝~ 分享我個人的經驗。我曾經做過一個TA cloning，一個月都做不出來。當時想怎麼可能？TA cloning從大學做到碩士畢業，沒有上百也有數十次，只有colony的多寡，不可能會完全做不出來。我當時遇到的情形是，比例調得再完美，再細心，就是沒有白色的colony，就算是藍色的也很少。這時候可能會覺得是transformation的問題或者是ligation的問題。很不幸的我做了一個control，只有放vector加ligase去self ligation。實驗組就是有加insert。結果是control組長滿了藍色的colony，實驗組只剩10顆藍色colony，白色的只有1顆，抽出來check的結果也不是我要的大小。為什麼呢？因為我放進去的fragment E.coli不喜歡。我猜你的東西八成是病毒的基因或者是某個很重要的transmembrane protein才會遇到這種情形。我的建議是，如果只是要用來送進mammalian cell表現，那你可以在你的fragment中間加一個intron。也就是分成三步驟: 1. N terminal 2. intron 3. C terminal。這種情形下以我朋友的經驗就可以做得出來了。如果你是要用來純化protein.. 那你可能要考慮用yeast或者細胞去表現你的protein了。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.56.130.95