Re: [求救]請問PCR products用restriction enzymeꐠ…

看板Biotech (生命科學)作者albertwang (會思考的魚)時間17年前 (2008/08/14 12:36)推噓0(0推 0噓 0→)

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※ 引述《calmato (Anita~)》之銘言： : ※ 引述《albertwang (會思考的魚)》之銘言： : 不好意思~因為我是第一次接觸分生~很多東西都是自己try : 或找資料或問人~所以有很多東西~不知該怎麼問或該注意什麼 : ~所以真的很不好意思~遇到很多問題卻自己一直沒法解決 >"< : 廠商給的information 是只有說 To make 100uM stock solution : add 255 ul of buffer : 我的working primer是從這裡面取10ul primer + 90 ul water : 那我把我的所有try的條件po上來~但不知道這樣是不是您說的反應條件? : 跑PCR ，total volume 30，water 19.85，primer Forward and reverse : 各1，10x dNTP 3，10xPCR buffer 3 ，Taq 0.15 ，Template DNA 2 : 以上單位都是ul。但我的DNA濃度品質不一~OD從 40~800 ng/ul : 10x dNTP 3，Template DNA 2 這兩個可以少ㄧ點不過你已經可以做出來那就不用改了不然出不來又麻煩了使用restrition enzyme: PCR products 5，water 16.4，10x Buffer 2 : 50X SAM 0.6，enzyme 1；total volume 25，使用的廠牌是Fermentas : 它的protocal是PCR reaction mixture 10ul(~0.1-0.5ug of DNA) : water 18 ，10X Buffer Tango 2，50XSAM 0.6，enzyme 1-2 : 因為考量到我的PCR products加10會切不完整，~所以才加5，但照我的想法 : 我的DNA量不算太少，切出來應該會很清楚，但不知為何拍出來照片都很淡 : 我一直找不出原因。 : PCR products 5 這個體積是你純化過的體積還是pcr 後30ul取出來的體積不過兩個情況都太少ㄧ點除非你的product 粉濃如果你怕切不完整那就加長切的時間依你加的enzyme 1 除非是相當特殊的不然16hr應該都還可以work 也想請問您剛說用酒精沉澱，是如何做呢? : 以上很冗長，感謝您的指教!! 以上有一些問題鄉民回答的就不贅述(如buffer) 酒精沉澱方法你可以到辜狗那找ㄧ下ㄧ定有至於你這邊沒有交代妳所run gel 的濃度是幾% 不過會出現太淡的話又想要和primer 分開ㄧ個就是大於5%gel ㄧ個就是用長片(30cm)的gel如果貴實驗室沒有那可以用跑protein page去做然後用低伏特run -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.114.96.242