Re: [求救]請問PCR products用restriction enzymeꐠ…

看板Biotech (生命科學)作者xenograft (努力嘗試學以致用中)時間17年前 (2008/08/15 02:18)推噓0(0推 0噓 0→)

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: 我在還沒切的PCR products 是198 bp，使用restriction enzyme是會分成為 : 20bp、78bp，但切前和切後我發現，切前marker 的100bp指標下每個sapmle : 都會有霧霧的一條(有的人說那是primer的殘留，但後來跑PCR時我的primer : 只加1μL，原本這樣的情況已經不見了，但這次我換了另ㄧ家廠商的Taq，不知 : 這和Taq的關係大不大 ? 因為換了後這次又出現了那條淡淡的ban)，這樣和我 : 有切的照片看起來，會覺得我有切的那照片真的切出來的下面一條是78bp還是 : promer的殘留? 唔...根據以前的經驗通常primer dimer不會多長跑膠時跑久一點就可以比較明顯的分出了而且應該要先check primer sequence是否會形成dimer 然後根據下文的condition 我覺得primer濃度可以再下降些我們實驗室是以總體積20μl primer濃度2μM各取2μl 這樣子就可以減少primer dimer形成的機率 : 另外一個狀況是，我的templete DNA是口腔黏膜細胞，其實量的品質很不 : 一定，拿去跑PCR，不切的話ban算亮的，但ㄧ拿去切，就變的很淡，有沒有什 : 麼方法可以讓他清楚點?? DNA去測OD範圍有點廣 40~800 ng/μL，我一直try : 條件，感覺都try不到比較好的狀態。想 : 請教各位前輩!感激不盡! 這邊的話我覺得相同DNA的總量會比加入相同體積好你可以做PCR前先測DNA的濃度然後調整到每管DNA的量約在160-200ng之間這樣子也可以減少因DNA量少而生成primer dimer的可能此外DNA量增加也比較容易去分辨是否為primer dimer 如果真的擔心鹽類會影響digestion的話是可以用一般的Phenol/Chroloform的方式來純化DNA 但是要注意有機溶劑很容易影響之後的digestion 會導致原本可以digest轉變成無法被digest 另外降cycle數也是個減少鹽類的方法只是這樣的話template的量就要增加還有跑膠...我之前的實驗用1.5% agarose gel就可以分出100bp左右的band了 (我們實驗室用的是Seakum Agarose Gel) 不過像是這種比較小片段的DNA可以嘗試使用"Nu Sieve Agarose gel" 它號稱可以分出最小50bp的片段不過似乎比較貴些以上是我之前的經驗希望對你能有幫助囉^^ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.142.224