Re: [求救] 分段cloning
※ 引述《veltine (Time go by~~~)》之銘言：
: 3.5kb說大不大、說小也不小…
: 這個gene在我手上就是clone不出來…Orz
: 提到primer專一性不夠的原因，我的primer設計出來有33-35mer
: (含有酵素切位)，我也blast primer在NCBI上，確時是會有blast
: 到genomic DNA，但是我的total RNA已經用DNase I處理過，PCR
: 出來還是有很band…而且在1kb的位置特別亮…
: 想問的問題是要怎麼提高我的primer專一性，長度夠、GC%也正常
: 在47和50%、Tm為72和76…還有那個地方要注意的嗎？
先無差別clone起來再去做Rapid Screen,挑出你要的3.5K的clone來做...
請問是用Taq去P還是用Pfu?
用Pfu P完直接ligation是接不起來的歐...
: 另外，我的第二個問題，為什麼會這麼問，是因為牽涉到primer設
: 計上考量，假如是先接好我要的gene，這樣子primer酵素切位的設
: 計上，就簡單多了，問題是non-circular的片段可以用ligase接起
: 來嗎？
1.將你步驟一PCR出來的3.5K片段clone進T-A cloning vector...
挑出來之後純化 > 用你設計的酵素double digestion > 酒精沉澱,回溶
2.將你的vector以你要的酵素做double digestion > 酒精沉澱,回溶
3.算好molar ratio後將1.2.加在一起ligation
便宜簡單又不用check正反接
: 假如先接上某一片段，primer酵素切位的設計上就很傷腦筋了…
: 由於我用的vector是自己做的，切位由5'開始，只有NheI、PacI
: 、PmeI和NsiI可以用…
: 舉列來說：
: NheI---1.7kb---NsiI
: NisI---1.8kb---NsiI
: 先接上1.7kb到vector，之後再接上1.8kb…不過還要再check是正
: 接還是反接…Orz
: 我想到的分段接的primer酵素切位只有這個，還有其它的方法嗎？
: 話說回來，有個gene約1.5kb，primer Tm為72和82，我用52℃就
: 可以得到single band…哎…cloning真是很神奇的實驗…Orz
因為你Tm要是設太高primer跟template已經是若即若離了
太嚴苛的條件是P不出來的...
太長時間擴增,長時間高溫也是不好...
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 210.69.150.30
討論串 (同標題文章)
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
138
258