Re: [求救] 如何對ChIP後抓下的promoter做PCR?

看板Biotech (生命科學)作者soom時間17年前 (2009/05/12 14:23)推噓3(3推 0噓 1→)

留言4則, 2人參與討論串3/3 (看更多)

原文恕刪會做到ChIP一般是想要知道某transcription factor是否能夠在mRNA的層面上，對目標基因做直接的調控，也就是該TF會結合上目標基因的promoter (所以此時你們應該已經先有 A -> B這樣的假說，但是看你的發文似乎還沒有）如果沒有的話，會建議你們先找出上述可能的假說，找法很多，例如把A大量表現在某個細胞，然後看看B的表現量有沒有被影響或是找看看有沒有將A大量表現以後做microarray的data，從中找候選基因等你建立類似 A -> B 的假說後就好玩啦，因為理論上你會得知B的promoter序列，那麼你可以用PCR去放大該promoter片段，就可以 1-a 電腦預測結合位: 如果A已經有所謂的putative binding site，那麼可以將promoter的序列拿去跑分析預測有沒有A的結合位（但是你們的狀況似乎是沒有這樣的資訊，所以必須要做下面那步） 1-b promoter activity reporter assay: 把PCR放大的片段後面接上冷光基因(leu) 然後看看大量表現A有沒有影響冷光的量，並且藉由截取部分promoter的方式確定A結合在promoter的位置，由這個實驗可以將A結合的位置縮短到100 bp 以下，如此便可以得知接下來EMSA的probe以及ChIP的PCR的位置 2. EMSA: 將DNA probe跟A加在一起然後跑膠，可以看在in vitro狀況A有沒有結合在promoter上 3. ChIP: 在細胞中先將DNA跟A結合，然後再藉由純化A共同將DNA純化出來後續可做很多實驗，PCR確認的話可以從1-b的資訊知道在哪設計primer 有錢想要得到較多資訊的話可以做ChIP-chip，把ChIP抓下來的DNA拿去做 microarray(目前價格以萬做單位) 超級有錢想要得到未知資訊以及好SCI的paper 可以做ChIP-Seq，把DNA拿去做重新定序(re-sequencing, 目前價格以十萬做單位) ChIP其實是個非常強力的工具，配上microarray或是re-seq甚至連Chromosome territory都可以開始做研究呢（有錢的話）...離題了，以上希望能對你有幫助，如果有錯誤還請版上其他板友補充指正，謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.74.21