[討論] His-tag protein 純化問題
大家好
最近都在做蛋白質純化
使用的是 Ni-NTA 來純化帶有 His-tag 的protein
原理和實驗方法我都有從網站上的protocol搞懂了
也有爬過文
目前比較困擾我的事情是
流速會越來越慢......有時候甚至就塞住了 = =
我們家使用的是自己packing膠體
我有照學長說的
每次使用前pipette一下讓他重新packing 以免久了膠體會結塊容易塞住
也照protocol說的
先用水洗掉20%酒精 再用10 mM imidazole 平衡 避免沉澱產生
然後我濃縮置換好的sample在過column前也有過0.45 um膜 以免雜質堵塞膠體
但有時候還是會流速越來越慢
剛甚至在水wash的時候居然就塞住不動了 = =
所以想請教各位前輩
還有什麼可能造成堵塞呢?
我才沒用超過3次
之前的經驗大概流速會是 400~600 uL/min
請大家給我一點建議吧
謝謝
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◆ From: 140.112.74.19
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我們家的膠體不知道是幾百年前買的......沒有說明書
我有看我找的 Invitrogen 和 QUIAGEN 似乎沒有提到堵住的可能原因和處理方法?
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我是以Pichia生產胞外蛋白 不用破菌 所以離心收上清液後就濃縮 置換buffer
過 0.45 um 之前過 0.22 um 覺得跟 0.45 um 差異不大 所以後來都用 0.45 um
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喔ˊ 這的確有可能 好我會試試看 謝謝你
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這是指clean up 嗎?
使用時機是......?
而且用NaOH wash 的話要調回pH不是會用到很大量的buffer嗎?
※ 編輯: littlelizard 來自: 61.224.33.17 (09/04 01:50)
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7年前
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