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[求救] 新手想請問關於SDS-PAGE的問題

看板Biotech (生命科學)作者 (Chin)時間16年前 (2009/11/08 11:37), 編輯推噓12(12推 0噓 50→)
留言62則, 10人參與, 7年前最新討論串1/1
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 以方便板友幫您追蹤問題 ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- 我是做10%gel 0.75尺寸的膠 sample 和 2X sample buffer 是1:1 然後會用1X sample buffer去補到同體積(補到24ul) (2Xsample buffer: sample buffer 95ul + BME 5ul 1X : 2Xsample buffer 50ul + MQwater 50ul) Q1 看BIO-RAD說明書上寫 10WELL的一個WELL可以low33ul體積 我一個sample需要low進well的量只有24ul 可是不管我怎麼小心、緩慢的low 還是會滿出來 可以很明顯看到淡藍色沿著well的"凹"字底部溢出道"凹"字兩個高點 我是拿20ul的pipement轉到12分兩次low 通常要low第二次時，就感覺已經快滿出來了 觀察sample的沉降，覺得還好，也是會沉下去 但就不會像mark一樣完全沉在well底部變成一條線 我老闆說我可能low太快，把sample衝上去，或是sample buffer配不準 但sample buffer配法就如同第一段所寫 low的速度也確實很緩慢了 ------------------------------------------------------------------------------ Q2 想請問大家是怎麼配膠的? 我自己的配法是照我老闆所說 配方都加到15ml管後，VOTEX約10秒 倒進去玻璃內 可是有同事跟我說votex會讓膠的結構被破壞 跑出來的band會扭曲，不會是一直線 ex放大圖: 扭--^---^^- 直--------- 我自己在跑，明明做法都一樣，但有時候跑出來是直的，有時候卻會是扭的 然後，跑的時候扭，壓出來也是扭的>"< 我們家跑上膠是固定電流0.03A，下膠是固定電流0.06A 但是常常會到達最高電壓250V 我同事說我們家跑的電壓太大@@" 所以才跑不漂亮 ------------------------------------------------------------------------------ 我以前從未跑過western 最近跑過幾次，都有一些疑問，很希望可以把膠跑得漂亮 想請各位前輩幫忙指點一下 十分感激 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 114.40.219.15
推
11/08 12:08, , 1F
load sample前你會沖洗well嘛?
11/08 12:08, 1F
推
11/08 12:24, , 2F
vortex會破壞結構XDDD 網狀結構是倒下去才慢慢形成
11/08 12:24, 2F
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11/08 12:24, , 3F
的吧? 15cc的配到10cc以上難vortex 可以改用50cc
11/08 12:24, 3F
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11/08 12:25, , 4F
震個1.2下均勻就好 10秒會有很多泡泡吧?
11/08 12:25, 4F
推
11/08 12:34, , 5F
dye 加多一點,讓sample重一些好沉,電壓確實太大,要不然就放
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11/08 12:35, , 6F
冰上跑,電壓這麼大會很燙,電壓大也會扭
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11/08 12:56, , 7F
用尺量一下齒槽大小換算一下體積 就可以猜可以 load 多少啦
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11/08 12:57, , 8F
不過要估少一點 0.75mm 膠片 我手殘 我都只會 load 20ul
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11/08 12:59, , 9F
電壓太高會過熱 膠的孔洞會不均勻 就會歪歪扭扭
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11/08 13:00, , 10F
除非有 cooler 或是丟cold room
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11/08 13:01, , 11F
配 SDS-PAGE 用 stir 就好 用 Vortex 會產生氣泡 很麻煩
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11/08 13:02, , 12F
體積少的時候用 pipette 也可以:P
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推
11/08 14:03, , 13F
我用離心管(回收)配膠 蓋上後不搖只用手旋轉後就可鑄膠了
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11/08 14:04, , 14F
另外loading量.75我都只load 2~4uL 從未load到滿過...
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11/08 14:05, , 15F
sample的蛋白量就要算得很精準 這樣跑出來的結果很漂亮
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11/08 14:08, , 16F
跑膠時我都定電壓 上膠60~70V下膠95~110V只有Transfer時才設A
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11/08 14:09, , 17F
不過.75的gel因為loading量太少 我都改1.0 or 1.5
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11/08 14:10, , 18F
這樣sample量就可以拉高不少,但最多也只load到30uL
11/08 14:10, 18F
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11/09 00:40, , 19F
下膠凝固後要做上膠之前和上膠拔掉齒梳後 我都會用
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11/09 00:40, , 20F
running buffer 沖洗3次
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11/09 00:46, , 21F
用vortex的確很容易起泡，我會偷偷用drop把泡泡吸走再倒
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因為我們的sample濃度不高 所以low的體積就...而且很珍
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11/09 00:51, , 23F
貴 所以暫時無法再取得。想請問一下，如果不加1X dye補
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11/09 00:53, , 24F
成同體積 跑出來會很醜嗎?
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11/09 00:55, , 25F
loham大大，請問dye的增加是指?2x dye和sample比例不是
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11/09 00:55, , 26F
一定要1:1嗎? 抱歉，我對於這方面真的很不熟...>"<
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11/09 00:56, , 27F
謝謝樓上各位前輩這麼熱心回答 受益良多 >"<
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11/09 00:59, , 28F
DFS大 我們剛好跟您家相反呢...跑膠時固定電流 TRANSFER
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11/09 01:01, , 29F
時則是固定電壓(15V) 一次只transfer一片GEL
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推
11/09 01:20, , 30F
sample buffer + sample 可 = 1:2 = 5ul + 10ul
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11/09 01:21, , 31F
蛋白濃度若太低可濃縮
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11/09 01:22, , 32F
配膠千萬別vortex，氣泡的確會破壞結構和影響凝膠
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11/09 01:25, , 33F
固定電壓或電流都，但固定電壓比較保險。電流較多變因
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推
11/09 01:53, , 34F
我的意思是dye在sample比例增加,樓上你是不是打錯啊? 這樣
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11/09 01:54, , 35F
sample buffer(dye)更稀耶?
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11/09 01:55, , 36F
怕體積太大就用4X dye阿~
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推
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我們家學長是管耗材的,他都是4X dye當2X用,load起來超沉的
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11/09 02:03, , 38F
據說增加sample的鹽類也會比較重,可是這我沒試過,我同學是把
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11/09 02:05, , 39F
補體積的DDW用PBS取代,聽說會比較沉,這個我也沒試過
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推
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電流電壓其實只要懂原理,國中理化公式代一代,怎麼跑怎麼OK的
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推
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我意指每well容積只要15ul就很足夠了。
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11/09 02:11, , 42F
不管是定電壓或定電流,注意溫度,溫度影響蛋白外也影響電阻
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若用PBS，鹽類會增加電阻，lane的邊邊容易拖尾
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影響電阻,電流電壓就會變,runing的狀態怎樣就可以體會了
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11/09 02:14, , 45F
所以增加鹽類不是好方法阿~~ 受教授教! 還好沒試XD
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推
11/09 02:17, , 46F
跑膠時固定電壓或電流影響較小，但transfer時-
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11/09 02:18, , 47F
固定電流需注意每張紙大小必須裁的剛剛好，否則電流-
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往電阻比較小的低方去，則影響效率
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推
11/09 02:19, , 49F
那要看機器,我用過超多牌子的,現在實驗室用的Hofer最容易冒
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11/09 02:21, , 50F
煙,電壓高的時候不放冰包都超燙,膠會變形orz 用來用去台製
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11/09 02:22, , 51F
東生便宜又好用
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11/09 09:40, , 52F
load快一點看看 有時候太慢 擴散開來 反而停在很高的地方
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11/09 10:30, , 53F
我也用hofer跑膠and Transfer 整個system就放4度C冰箱內跑
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11/09 11:09, , 54F
因為 Hofer 的膠比較大片 電阻相對就高呀 :D 不要加蓋就好了
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11/09 11:10, , 55F
但是bio-rad 的系統好像一定要加蓋 太久沒用 忘了
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不加蓋可以降一點點溫度
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推
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東生好用+1 塞冰塊下去 400 mA 1h 水都還是冷的
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有種專門load樣品的tip 前端很細 load大體積 較不會溢出來
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11/10 10:42, , 59F
上面400 mA 指的是transfer時 XD
11/10 10:42, 59F
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11/10 21:50, , 60F
謝謝大家的意見 感覺好有收穫 再次感謝喔^_^
11/10 21:50, 60F
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11/11 01:50, , 61F
但是bio-rad 的 https://noxiv.com
11/11 01:50, 61F
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01/03 17:03, 7年前 , 62F
跑膠時固定電壓或電流影 http://yofuk.com
01/03 17:03, 62F
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