Re: [求救]關於長片段的TA-cloning

看板Biotech (生命科學)作者biingru (Worker)時間14年前 (2010/05/22 03:59)推噓0(0推 0噓 4→)

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※ 引述《DJHINN (dj)》之銘言： : 發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出 : 以方便板友幫您追蹤問題 : ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章---- : 我要將差不多 6.3k的 PCR product insert 入 3.6 K的 TA vector : 但是頻頻失敗 : 目前用過的莫耳比為 : 6.3K product : 3.6K vector = 1:3 : 我是將 vector 當作 insert看待 : 因為 product>>>>> vector : 但是仍是失敗 : 有學姊是比較反其道而行 : 他的比例是 : 6K product : 3K vector = 8 : 1 (接下來會試看看) : 做出來了，可是我不知道其理論是甚麼!? : 請有做過類似實驗的大大給個幫助一下 ~"~ 做 Vector Cloning 完全屬於雖小不管你的 insert 跟 vector 怎麼比例一定要剛剛好 insert 碰到 vector 的切點，再加上剛好 ligase 再旁邊還要剛剛好有個 ATP 在旁邊，這幾個東西同時出現在同一個發生點上 ligation 才會成功我不知道您的 TA-cloning 是用哪一個 kit 就我試過最方便的是 invitrogene 出的我記得應該有個步驟是 room temp. 放個 10 分鐘還是多少就是你把所有東西都喇在一起後的那個步驟，試試看延長到30分鐘或20分鐘，時間增長，增加這些東西碰在一起的機會說穿了做 ligation 做 transformation 事實上跟技術無關。都掌控在細菌他自己的狀態 competent cell preparation 洗久一點，細胞膜就破破爛爛 plasmid intake 就比較多，但是recovery 不好或是有人用 heat shock 90 秒做的出來換個人就要用 40 秒才可以若是用 elecroporation 的方法，細菌跟 plasmid 的溶液鹽類就不可以太高不然就爆爆樂一我的經驗就是抓個中間直，自己慢慢試東西做出來比較重要，試試看實驗室有經驗的人的方法試著去體會 know why is more important than know how 會對於您解決問題上有很大的幫助小小經驗，希望對您有幫助，您可以參考看看。 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 141.225.147.189

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