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[求救] 抽RNA的器具要不要滅菌?

看板Biotech (生命科學)作者 (koalawoman)時間14年前 (2010/09/10 19:19), 編輯推噓19(19推 0噓 57→)
留言76則, 21人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
我上班兩個禮拜以來，一直都在做抽細菌的RNA和PCR，因為我對分生實驗室不了解，所以 當初拿到PROTOCOL時，以為是很成熟完整的實驗架構，可是我一直都做不出來老闆要的， 我去問了很多人才發現，我們的實驗架構很有問題，也才知道別人是怎麼做的，其中一點 是抽RNA的tip和eppendorf應該要拿去滅菌，尤其我是再開放式的空間抽RNA和PCR，我跟 老闆說，老闆說滅菌過後會更髒，因為水蒸氣會跑進去盒子裡，水有Rnase和DNase，我說 要噴酒精，老闆也說沒用。 我想請問滅菌真的沒有用嗎? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.118.160
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09/10 19:20, , 1F
還有要怎麼說服老闆?
09/10 19:20, 1F
推
09/10 19:35, , 2F
滅菌鍋用的水是Q水怎麼會有RNase?!你們是加自來水+口水
09/10 19:35, 2F
推
09/10 19:58, , 3F
這樣 直接用DEPC H2O+ filter tip吧! 滅菌去不了RNase
09/10 19:58, 3F
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09/10 20:19, , 4F
是用什麼方法抽? 我覺得方法也有差耶
09/10 20:19, 4F
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09/10 20:20, , 5F
不滅菌是有些罕見 不會是買已經滅好的吧...
09/10 20:20, 5F
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09/10 20:44, , 6F
老闆給我一個夾鏈單上面寫DNASE和RNASE free的器具，
09/10 20:44, 6F
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09/10 20:45, , 7F
可是要自己裝進罐子和TIP盒子裡!這樣算是滅好的嗎???
09/10 20:45, 7F
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09/10 20:50, , 8F
是用geneaid的Total RNA Mini Kit
09/10 20:50, 8F
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09/10 21:04, , 9F
我這週末會再做一次，因為之前連酵素在冰上，我都不知
09/10 21:04, 9F
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09/10 21:05, , 10F
道，而且菌數也不對，滅菌的問題無法解決，也沒有
09/10 21:05, 10F
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09/10 21:07, , 11F
FILTER 的 tip,另外，primer的溫度也不太對，如果最後
09/10 21:07, 11F
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09/10 21:08, , 12F
改了還是做不出來，在跟老闆說要不要考慮去滅菌.....
09/10 21:08, 12F
推
09/10 21:25, , 13F
買回來的tip跟eppendorf不都是RNAase free的嗎?
09/10 21:25, 13F
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09/10 21:26, , 14F
我以前隨便抽都可以抽的到，放心吧沒有那麼難抽啦~
09/10 21:26, 14F
推
09/10 21:33, , 15F
RNA很好抽 只要動作快習慣良好就好
09/10 21:33, 15F
推
09/10 21:37, , 16F
我們家是器具滅菌後~用180度烘箱烘Overnight再用~~
09/10 21:37, 16F
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09/10 21:38, , 17F
溶液都會用DEPC處理
09/10 21:38, 17F
推
09/11 00:55, , 18F
水蒸氣會把RNase帶進盒子裡嗎?
09/11 00:55, 18F
推
09/11 01:25, , 19F
RNase不是酵素嗎? 那麼高的溫度不會死?
09/11 01:25, 19F
推
09/11 01:57, , 20F
當在配製RNaseA溶液時 需經過"煮沸"這個步驟來殺死DNase
09/11 01:57, 20F
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09/11 01:58, , 21F
這樣夠耐命了吧XD
09/11 01:58, 21F
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09/11 02:02, , 22F
pipette拆開用3% H2O2擦過裡面, eppendorf tip用鑷子補
09/11 02:02, 22F
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09/11 02:04, , 23F
不需要滅菌 記得eppendorf tip整箱買來時 先拿幾包給RNA用
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09/11 02:04, , 24F
凡是拿取RNA用的東西, 最好使用乾淨手套 口罩
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09/11 02:07, , 25F
所有試劑都要RNase free 酒精 氯彷... 需另買RNA專用的
09/11 02:07, 25F
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09/11 02:08, , 26F
如果有個抽屜或櫃子專門放RNA use的東西最好！
09/11 02:08, 26F
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09/11 02:14, , 27F
DEPC是劇毒, 使用請帶口罩 手套 1:1000溶於3次水
09/11 02:14, 27F
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09/11 02:16, , 28F
直接配在乾淨的血清瓶中, 在抽風櫃中用轉子攪拌overnight
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09/11 02:17, , 29F
隔天滅菌, 殺死DEPC（此時水呈現弱酸性 適合保存RNA）
09/11 02:17, 29F
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09/11 02:20, , 30F
瓶子跟轉子可以用1N鹽酸浸泡除去DNA, RNA滅過菌大概就掛了
09/11 02:20, 30F
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09/11 02:23, , 31F
操作時, 鋪抗污紙 手套 口罩必備, 最好別聊天 (切身之痛)
09/11 02:23, 31F
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09/11 02:26, , 32F
開放空間最好選擇沒人的角落
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09/11 02:28, , 33F
其實, 3% H2O2已經蠻威的了, 我刮棒都洗完泡20mins 擦乾
09/11 02:28, 33F
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09/11 02:30, , 34F
reuse一樣好端端的, 抽完的RNA保存在4度, 一週以內都還好
09/11 02:30, 34F
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09/11 02:31, , 35F
跑agarose gel還是好端端的2條band
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09/11 02:32, , 36F
抽細菌的話應該不能滅菌, 因為細菌的genome會炸出來的
09/11 02:32, 36F
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09/11 02:34, , 37F
細菌沒有intron 沒辦法跨, 可能更需要注重genomic DNA污染
09/11 02:34, 37F
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09/11 02:35, , 38F
抱歉 我還沒看完就推文... 沒看到你做的是細菌....
09/11 02:35, 38F
推
09/11 05:26, , 39F
剛買來的TIP的確不用滅菌 我們實驗室只有跟細胞培養有關的
09/11 05:26, 39F
推
09/11 05:30, , 40F
才會進行滅菌
09/11 05:30, 40F
推
09/11 05:36, , 41F
不如請s大把實驗流程跟大家說明一下吧　一起討論
09/11 05:36, 41F
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09/11 08:25, , 42F
看到大家的意見真是太感人了，因為我是應屆畢業生，以
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09/11 08:26, , 43F
前實驗室也不是做分生實驗，所以我在做的時候有好多個
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09/11 08:27, , 44F
疑問，但因為老闆也不清楚，因為他也不是做這個，所以
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09/11 08:28, , 45F
我也真的很無奈，我會先改些條件，週末結果會出來如果
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09/11 08:29, , 46F
還是不行再來打整個流程，太謝謝大家了!
09/11 08:29, 46F
推
09/11 10:20, , 47F
我們家抽RNA的eppendroff也沒滅菌 因為來的時候就是無菌狀
09/11 10:20, 47F
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09/11 10:21, , 48F
態 只要注意一下實驗周圍清潔 應該不需要太煩惱
09/11 10:21, 48F
推
09/11 17:31, , 49F
實驗室抽RNA的eppendroff跟tip也都是直接用沒有滅菌
09/11 17:31, 49F
推
09/12 00:11, , 50F
不滅菌是可以的,但是要帶乾淨手套,以及不要邊抽邊交談,
09/12 00:11, 50F
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09/12 00:12, , 51F
geneaid的kit應該不會有問題,但buffer若要加酒精,請加100%
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09/12 00:14, , 52F
無水酒精而非工業用酒精,另外應該就是菌數要對且健康....
09/12 00:14, 52F
推
09/12 01:10, , 53F
RNase高溫會denature 但回到室溫又會renature 所以囉...
09/12 01:10, 53F
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09/12 11:18, , 54F
居然要加無水酒精，老闆好像不是加這個耶!
09/12 11:18, 54F
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09/12 16:15, , 55F
插ｔｉｐ跟裝小離心管的時候要店店　然後滅菌　醬就ｏｋ
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09/12 16:15, , 56F
帶手套插　噴點酒精
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09/12 16:53, , 57F
無水酒精室溫下很快就變95%的囉~
09/12 16:53, 57F
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09/12 19:02, , 58F
所以加一般95%酒精有關係嗎?
09/12 19:02, 58F
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09/13 02:12, , 59F
我都用95%下去算... 抽DNA RNA OK
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09/13 02:13, , 60F
題外話, 抽nimi的 kit用工業酒精也沒啥問題= ="
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09/13 02:13, , 61F
(無水酒精好貴...ORZ)
09/13 02:13, 61F
推
09/14 13:34, , 62F
我們RNA USE的tip和eppendorf都會開新到的貨
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09/14 13:35, , 63F
也就是封口袋只會打開一次 tip用鑷子插...
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09/14 13:35, , 64F
其它物品只要有關抽RNA都是獨立一套
09/14 13:35, 64F
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09/14 13:36, , 65F
當然滅菌會進行 只是注意從打開袋子的同時
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09/14 13:37, , 66F
全程戴手套 戴口罩
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09/14 13:37, , 67F
最後抽不抽的到就是運氣了....
09/14 13:37, 67F
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09/14 13:38, , 68F
在說你的RNA穩不穩定 那也是另一個問題y
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09/14 13:39, , 69F
有人不戴口罩 邊講話邊抽 RNA也抽的到= = (無奈)
09/14 13:39, 69F
推
09/15 20:16, , 70F
我以前做了兩年隨意抽白血球RNA的實驗 其實真的沒那麼難
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09/15 20:17, , 71F
只有TIP用filter的 其他的都沒有很特別準備酒精是100%+DEPC
09/15 20:17, 71F
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09/15 20:18, , 72F
每次抽出來的量都很穩定滿多的 就算以乾的RNA保存兩年
09/15 20:18, 72F
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09/15 20:19, , 73F
測出來的mRNA量也沒有少太多不過tip不要滅過我老闆也這樣說
09/15 20:19, 73F
推
09/20 17:58, , 74F
之前跑RNA是把pipet拿去滅菌...還蠻有效的
09/20 17:58, 74F
推
09/22 03:34, , 75F
我們實驗室用unfilter tip/買RNase free H2O來抽RNA
09/22 03:34, 75F
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10/03 18:23, , 76F
你 18S/28S rRNA 的品質呢？如果沒有 smear，那就不用擔心。
10/03 18:23, 76F
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