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[求救] 長片段ligation+primer desing

看板Biotech (生命科學)作者 (monicatsen)時間15年前 (2010/12/09 23:45), 編輯推噓4(4推 0噓 5→)
留言9則, 5人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
最近在做長片段的ligation insert片段為2.3k vector 6.4k 但一直接不起來 塗盤都沒長clone insert及vector酵素切overnight 接著做純化 ligation 現在用的條件是照ligase的protocol I:V=3:1 22度 overnight 勝任細胞也是用買的(其他人用ok) 基本上我所有使用的酵素、buffer其他人都有用 所以不覺得藥品的問題 目前的策略是 先將PCR product送定序確認是否為目標基因 及再重新抽新的vector再重新切過 想問一下大家有沒有其他的建議 另外想請教大家: 我爬了前面的文章 有提到關於RE site 我在primer設計的時候 沒有在酵素切位前多留nt ------XXXXX (-是酵素辨認的序列，X是我的目標基因，-前面我沒多留nt) 這對接長片段insert會有影響嗎?(怕RE沒辦法認?) 又如果我要重設primer應該要補多少個nt 而這些nt是不是有建議要ATCG哪一個比較好? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.116.97.104 ※ 編輯: monicatsen 來自: 122.116.97.104 (12/09 23:49)
推
12/10 00:11, , 1F
要不要先做TA cloning把PCR產物接進去再往下做做看
12/10 00:11, 1F
推
12/10 00:41, , 2F
你如果是用NEB的限制酶 可以去查一下 我記得都要多留幾個
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12/10 00:41, , 3F
base限制酶才能有效的作用 還有我也贊同樓上提的 先做TA
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12/10 00:42, , 4F
再去接會比較方便
12/10 00:42, 4F
推
12/10 01:02, , 5F
http://tinyurl.com/2yvp6r 剛剛提到的表 裡面有一些限制
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12/10 01:03, , 6F
酶的效率 有些需要多留base 才有辦法切的動
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12/10 01:32, , 7F
不是看oligonucleotides,要看linearized vector的表才是
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12/10 02:05, , 8F
推H大的那個 當初PCR也是根據那個 要注意切的時間
12/10 02:05, 8F
推
12/10 08, , 9F
不留mer是切不起來的~若真不想留mer，只能作TA cloning了
12/10 08, 9F
:28 ※ 編輯: monicatsen 來自: 120.126.52.76 (12/10 18:00) ※ 編輯: monicatsen 來自: 122.116.97.104 (12/10 22:28)
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