Re: [求救] 長片段ligation+primer desing

看板Biotech (生命科學)作者 (monicatsen)時間15年前 (2010/12/10 22:28), 編輯推噓4(409)
留言13則, 6人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
剛剛定序結果回來 我的PCR product是我要的target gene沒錯 然後 使用的RE是fastdigest(Fermentas)的產品 目前的策略是打算先做TA 所以 想問一下 我下列的想法對嗎? 因為實驗室的DNA polymerase都是有proofreading功能的enzyme 所以 我想另外買Taq DNA polymerase 然後先用有proofreading功能的酵素跑PCR-->切膠純化 再將純化的PCR產物用Taq做A-tailing 再接到 pGEM-T vector 也麻煩大家推薦一下便宜好用的Taq我只要用來做A-tailing即可~ 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 122.116.97.104

12/10 22:54, , 1F
跑完PCR直接做ligation應該也可以吧...
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12/10 23:07, , 2F
前篇有寫道因為是接2.3k 接不起來 聽大家的建議才用TA
12/10 23:07, 2F

12/11 00:04, , 3F
如果有其他種的勝任細胞,建議試一下,有時候某一種的勝
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12/11 00:05, , 4F
任細胞就是和某些plasmid不合...
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12/11 00:37, , 5F
有在賣pfu+Taq混合的polymerase,是叫superTaq嗎?? 忘了
12/11 00:37, 5F

12/11 00:39, , 6F
直接加A理論可以,但我沒真正嘗試過就是了,自己心裡會覺得
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12/11 00:40, , 7F
怕怕的,就這樣加在一起就會有A了,自己是覺得蠻不確定的XD
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12/11 01:42, , 8F
可以先純化pcr產物 然後加taq跟dATP反應一陣子就會有A了
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12/11 13:21, , 9F
platinum taq是proofreading+A tail阿 先把家裡的
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12/11 13:21, , 10F
enzyme搞清楚吧 不行的話A tailing也不難做
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12/11 13:22, , 11F
室溫過量taq過量A 30min就OK
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12/11 14:05, , 12F
我們家的是pfu 所以確定是部會有A tail 確定我要再另外
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12/11 14:06, , 13F
做A tailing 總之大家說的我都會再試試 謝
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文章代碼(AID): #1D0ZaR1J (Biotech)
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