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[求救] ligation都接不起來

看板Biotech (生命科學)作者 (小玲)時間15年前 (2010/12/27 11:12), 編輯推噓14(14推 0噓 42→)
留言56則, 16人參與, 最新討論串1/1
大家好,目前在進行ligation碰到了問題 請大家幫幫忙 我目前要接的insert是2k,而vector是8k左右 insert是從pGEMT上面切下來的 經過gel elute之後濃度約45ng,260/280為1.95 而vector濃度約55ng,260/280為1.85 試了幾個condition, V:I= 2:4,1:4,1:6,1:8,2:5,2:7,1:5,1:7,3:3 在16度裡overnight(至少有22小時,時間太長了嗎?) 然後跟JM109做transform,放冰上30min後塗盤 可是都沒長>< 然後跟學姊討論,學姊說不然做一個加LB recover的動作 所以又再試了一次 v:i=6:4,1:9,1:7 這次改用2x rapid buffer,之前都是用10x 然後這批是在4度c裡ligation兩天 做transform之前加了500ml LB(NO AMP) 37度裡1小時 之後用800rpm離一分鐘,菌有離下來 然後去掉上面400ml的LB,剩下的塗盤 只有6:4那個有長,但只有一顆>< 想請問大家說,到底出了什麼問題 因為insert也是從pGEMT上切下來的 會有切不完全的問題嗎? vector是之前實驗室接另一個基因的 再把insert基因切下來,把vector elute下來 (切位相同) 所以也是確定有切動,size一樣 因此想問問有經驗的老手,我是否還要修改哪個地方呢?謝謝~~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.109.55.238
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12/27 11:15, , 1F
不好意思再補充一點,第二次做ligation,v:i=1:7,1:9的部份,
12/27 11:15, 1F
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12/27 11:16, , 2F
insert濃度是25ng(之前用完了重新elute),另外有做positive
12/27 11:16, 2F
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12/27 11:17, , 3F
control,所以確定不是plate的問題,謝謝~
12/27 11:17, 3F
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12/27 11:53, , 4F
濃縮DNA吧 其他看起來都沒什麼問題 competent cell是自製嗎
12/27 11:53, 4F
推
12/27 12:07, , 5F
V:I用1:3，然後把除了ligase之外的東西都加好，接著用一杯
12/27 12:07, 5F
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12/27 12:08, , 6F
70度的水，把混有這些東西的eppendorf放進去(上浮船)
12/27 12:08, 6F
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12/27 12:08, , 7F
溫度降到30-40度時再拿出來離心加入ligase，ligate一小時就
12/27 12:08, 7F
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12/27 12:08, , 8F
可以拿去transform了。
12/27 12:08, 8F
F大的方法真的很有新意耶~我來試看看,接不起來真的好煩啊>< 另外想請問一下F大,降到30-40度是讓溫度慢慢降? 還是說70度裡要放多久???謝謝~ 加入ligase後是在幾度下做ligation呢?謝謝
推
12/27 12:19, , 9F
樓上這什麼怪方法 70度的水....
12/27 12:19, 9F
推
12/27 12:22, , 10F
有些人說ligation 前提高一下溫度,效率會比較好
12/27 12:22, 10F
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12/27 12:22, , 11F
應該是為了讓捲在一起的DNA先暫時分開
12/27 12:22, 11F
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12/27 14:45, , 12F
competent cell是買的~
12/27 14:45, 12F
※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:47) ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:48) ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/27 14:50)
推
12/27 19:04, , 13F
慢慢降
12/27 19:04, 13F
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12/27 23:11, , 14F
F大的方法: 把DNA展開 並逐漸降溫讓互補股稍稍靠近
12/27 23:11, 14F
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12/27 23:11, , 15F
但是我建議不要把buffer(ATP)也加溫了 怕有破壞
12/27 23:11, 15F
推
12/27 23:19, , 16F
請問V:I是體積比 重量比 還是莫耳數比?
12/27 23:19, 16F
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12/27 23:19, , 17F
另外請問ligation total體積? 使用的切位是甚麼酵素?
12/27 23:19, 17F
不是莫耳數比耶,是指的是體積比 使用的RE是EcoRI和SpeI vector是psin-EF2-vector,約8.5k
推
12/28 00:15, , 18F
當然是莫爾數比
12/28 00:15, 18F
推
12/28 01:43, , 19F
介紹一個promega的計算軟體http://www.promega.com/biomath/
12/28 01:43, 19F
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12/28 01:43, , 20F
進去後找到 Ligations: Molar Ratio of Insert to Vector
12/28 01:43, 20F
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12/28 01:44, , 21F
然後輸入I, V的大小以及V的ng數，系統會幫你計算I的ng數
12/28 01:44, 21F
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12/28 01:45, , 22F
最後再按照它建議的ng數調整體積即可
12/28 01:45, 22F
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12/28 07:02, , 23F
transformation有沒有出錯的地方阿?
12/28 07:02, 23F
transformation會出錯的地方是!? 我做transformation就是直接加入JM109,然後放冰上30分鐘後塗盤 之後做LB recover的動作就沒放冰上了,直接放37度一小時 難道是這部份錯!? 但之前放冰上30分鐘也是沒長..=____=
推
12/28 15:43, , 24F
ligase確定是好的嗎 ligase buffer不要在室溫回溫哦
12/28 15:43, 24F
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12/28 15:45, , 25F
還有依你的描述transform好像沒heat shock ?
12/28 15:45, 25F
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12/28 15:45, , 26F
是說commercial的不hest shock應該也可以啦
12/28 15:45, 26F
嗯我沒做heat shock的動作耶~ 不要在室溫回溫?我都是拿在手上然後等他回溫耶 ligase這部份我不確定耶,但之前做pGEMT ligation時他有長 那時候篩了約50顆有 不會之後又突然壞了吧.... 昨天有試了f大的方法 但還是沒長......(哭) 到底是什麼地方出問題??嗚嗚~~~~~ ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/28 16:51)
推
12/28 22:58, , 27F
用體積比計算是錯誤的 要用莫耳數比
12/28 22:58, 27F
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12/28 22:58, , 28F
按照你vector和insert的大小 V:I要1:3的話
12/28 22:58, 28F
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12/28 22:59, , 29F
vector建議150~200ng insert大概100~150ng或更多
12/28 22:59, 29F
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12/28 23:00, , 30F
將以"純水"回溶的純化過的vector與insert加入tube後
12/28 23:00, 30F
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12/28 23:01, , 31F
65度五分鐘 spin down然後馬上放冰上 再加入buffer ATP
12/28 23:01, 31F
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12/28 23:02, , 32F
與ligase, total體積不超過20ul(建議10ul)
12/28 23:02, 32F
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12/28 23:03, , 33F
依你的切位 放在12度C以下會比較好 over night ligation
12/28 23:03, 33F
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12/28 23:05, , 34F
ligation完後加入competent cell 混勻後冰上30~45min
12/28 23:05, 34F
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12/28 23:06, , 35F
雖然是commercial的 還是建議做一下heat shock...
12/28 23:06, 35F
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12/28 23:07, , 36F
42度90秒 (commercial應該30秒即可) 然後冰上5min
12/28 23:07, 36F
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12/28 23:08, , 37F
然後加入1ml LB,37度搖晃(250rpm)培養1hr..
12/28 23:08, 37F
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12/28 23:09, , 38F
養完後用8000rpm離心5min 去除上層medium 留100ul LB
12/28 23:09, 38F
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12/28 23:10, , 39F
懸浮後塗盤 (commercial的 LB可以只養30min)
12/28 23:10, 39F
好,謝謝你~我會再試看看的!!! 很謝謝大家的回應耶 你們人真好!!我要再努力看看~~~~~ ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 10:27)
推
12/29 12:04, , 40F
何不多花1分鐘做heat shock?
12/29 12:04, 40F
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12/29 14:16, , 41F
pGEMT+I是5k,你的I+V是10k,這樣的大小差異比可行性完全不對
12/29 14:16, 41F
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12/29 14:18, , 42F
沒用heat shock,而且10k還用JM109,要成功應該難上加難
12/29 14:18, 42F
請問大小差異比是什麼意思呢? 因為insert不也是要從pGEMT上切下來嗎?? insert:vector=1:4這種比例不好接嗎?? JM109比較難transformation嗎?? 謝謝~~~~ ※ 編輯: ennnnno 來自: 140.109.55.238 (12/29 15:46)
推
12/29 20:40, , 43F
應該說10k本身就不好轉進去，再不heat shock機率更低吧
12/29 20:40, 43F
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12/29 20:41, , 44F
然後你的vector應該也是自己製備的吧，或許比起商業的效率差
12/29 20:41, 44F
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12/29 20:43, , 45F
妳可以確認看看到底是沒接成功抑或是沒轉進去
12/29 20:43, 45F
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12/29 20:43, , 46F
個人認為轉型失敗的可能性較大啦
12/29 20:43, 46F
推
12/30 00:18, , 47F
你為什麼沒做heat shock????
12/30 00:18, 47F
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12/30 00:19, , 48F
我用的ligation buffer其實在室溫下回溫也沒差
12/30 00:19, 48F
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12/30 00:20, , 49F
而且heat shock完之後要用LB medium讓菌recover
12/30 00:20, 49F
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12/30 00:20, , 50F
時間也不用太長，大概十分鐘到十五分就可。
12/30 00:20, 50F
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12/30 00:21, , 51F
heat shock 30-90秒都可以
12/30 00:21, 51F
推
12/30 10:05, , 52F
原po原本用的是commercial的勝任細胞,照protocol做就是不
12/30 10:05, 52F
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12/30 10:07, , 53F
需要heat shock,也不需要recovery~ 這也不能怪原po
12/30 10:07, 53F
推
12/30 11:53, , 54F
喔喔，因為我也沒用過這種的細胞
12/30 11:53, 54F
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12/30 16:35, , 55F
有做control組嗎? 試試看把vector切一刀再接回去吧
12/30 16:35, 55F
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12/30 16:36, , 56F
會長的話至少可以確定不是transform的問題
12/30 16:36, 56F
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