Re: [求救] 請問RNA去除genomic DNA的方法

看板Biotech (生命科學)作者mattmatt (乎哩乎哩 N N )時間14年前 (2011/09/30 22:41)推噓1(1推 0噓 0→)

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分享一些經驗: 我們實驗室有在做植物與微生物(真菌) 使用的植物種類算一算有十幾種菌也有三四種以上抽RNA的方法不外乎TRIzol, spin column, ammonium carbonate 使用起來真的是要看樣本來調整像TRIzol很容易受到多醣, 二次代謝物, 和水分的影響讓分離RNA的效果變得很差,甚至pH跑掉無法使用所以只能抽一些簡單的草本植物物(菸草,阿拉伯芥等) 可以的話使用真空乾燥後的sample會有比較好的效果但sample合適的話,抽取的效果很好,蛋白和DNA殘留也較低 Spin column的話就是方便又快速各家廠商都有出一些有特色的抽取kit 也有針對具有多醣或是黏液的植物樣本的解決方案特別的可能就在他的extraction buffer有調整過如果以特殊樣品不好抽的,可以考慮找不同廠商問問這邊就不說廠牌了..因為真的要看樣品來決定 ammonium carbonate算是滿古早的分離RNA的方法跟CTAB有點像, 同樣做為extraction buffer 然後過PCI/CI去分離核酸, 最後酒精沉澱我的經驗是分離核酸的能力很強收到的核酸量都很高好處是奇奇怪怪的sample都有辦法抽(ex.竹子.仙人掌) 醣類或二次代謝物影響比較小缺點是耗時費力然後會分離到不少genomic DNA 一定要用DNase處理過至於genomic DNA的部分, 以上三種方法都會有gDNA殘留, 無一倖免如果你是做普通RT-PCR, TRIzol和Spin column所抽的RNA 轉成cDNA後 PCR影響是還好, 但cycle數較高還是可以p出來若是做Real-time PCR, 則全部都會測到gDNA 而我們實驗室有在用Roche DNase I以及Ambion TURBO DNA-free kit 我個人的感想是TURBO DNA-free kit雖然成本稍高但處理起來很快, 相對RNA的lost量較少, 但僅適用於少量的RNA樣本假如下的RNA(含gDNA)量太多,照protocol做完後,PCR還是會測到gDNA 若要使用的話,建議比protocol減少sample量,或是拉長DNase處理時間會比較好然後加入Inactive reagent後要很小心的回收,才不容易有DNA殘留這還有個缺點是被digest掉的核酸片段(或dNTPs)會保留在管內, 以吸光值訂量會受影響而Roche(或別家)的DNase I,去除gDNA效果很強,照protocol建議處理幾乎不會有gDNA在後續的RT-PCR或Real-time PCR中被測到缺點就是要過PCI/CI & 酒精沉澱去除DNase,處理比較費時 (不可加熱inactivate, RNA會被化學分解) 但過PCI/CI與酒精沉澱的同時被digest掉的核酸會順便被去除(片段太小不沉澱) 最後所得到的RNA最為乾淨,定量也不會受影響若你想回收的片段較大,此時可以配合LiCl做酒精沉澱可以得到不錯的效果,理由如下,有興趣的可以看一下 http://www.madsci.org/posts/archives/2000-07/965055056.Mb.r.html 大意就是說LiCl沉澱核酸的效果很好(注意同時包含DNA與RNA) 特別針對片段較大的核酸,小片段的核酸和NTP不會被沉澱下來所以可以得到較純的核酸(如果去鹽有確實) 若搭配DNaseI digest, 剛好可以去除DNA片段,得到乾淨的RNA 所以目前我個人偏好TRIzol/Ammonium carbonate做為buffer抽取RNA 可以得到較大量的RNA, 然後以DNaseI 處理, 過PCI/CI,酒精沉澱這樣得到的RNA還是比較乾淨謝謝收看,歡迎討論 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.160.230.84