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Re: [求救] gel extraction

看板Biotech (生命科學)作者 ( .＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿.)時間11年前 (2013/07/26 16:54), 編輯推噓5(5推 0噓 28→)
留言33則, 7人參與, 最新討論串3/3 (看更多)
※ 引述《TWX5566183 (塵世中一個迷途小五六)》之銘言： : 收完前一天用enzyme切的vector之後拿去跑膠 band非常亮 : (約8k多) : 接著再把膠切下來拿去做gel extraction : 收完之後取dna跑膠發現band不見了 : 想問問其可能的原因為何...謝謝 又一個受害者 先拍拍 這個主要的原因有兩點 也可以說一點 1. 你用的RE在gel extraction buffer裡面會degrade你的DNA. 2. 你切的gel比較大塊 在gel extraction buffer裡面溶比較久 (或者你跑去戰酸民 :p)所以degrade得很徹底 我會知道是因為我之前也一直為這個問題所困擾 有一次我用兩組 不同的RE切, 假設 A+B & C+D 好了 其中C+D我一直回收產量很低 我發現一樣的方法做下來 A+B這組回收的量比C+D高非常多! 如果你跟我一樣不能換RE, 我的解決方法是盡量把gel切小塊一點 , 比如說一大塊切成兩三塊小塊的 盡量減少溶gel的時間 人在旁邊 監控 不要等到全溶 溶到剩下一點點像米粒大小 就可以先拿出來放涼 等到全溶了 溫度也降得差不多 就可以直接過column純化 希望可以幫到忙 :) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.76.175.170
推
07/26 17:32, , 1F
1.RE在跑膠時還會卡在gel上?!不太合理喔
07/26 17:32, 1F
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07/26 17:32, , 2F
我倒是覺得是否是column的membrane壞了~
07/26 17:32, 2F
※ 編輯: puec2 來自: 211.76.175.170 (07/26 17:58)
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07/26 17:59, , 3F
RE黏在DNA上是比例問題 不是全有全無
07/26 17:59, 3F
推
07/26 18:29, , 4F
我比較好奇的是~哪家的RE的Exonuclease活性這麼強~
07/26 18:29, 4F
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07/26 18:30, , 5F
可以在gel elute時把band切的如此徹底乾淨到沒band
07/26 18:30, 5F
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07/26 18:35, , 6F
這麼強的活性在反應時不把DNA切光,卻靠殘留量把band切光
07/26 18:35, 6F
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07/26 19:38, , 7F
我不覺得是degrade,而是大塊gel跟elute後小量test視覺差異
07/26 19:38, 7F
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07/26 20:33, , 8F
真的是degrade 跑電泳check我還可以看到degradation拖的尾巴
07/26 20:33, 8F
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07/26 20:34, , 9F
至於活性 如果你用傳統方法抽過植物genomic DNA
07/26 20:34, 9F
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07/26 20:34, , 10F
你應該會知道有某些nuclease就算你用phenol/chloroform/IAA
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07/26 20:35, , 11F
洗過N次 就算你用超高速離心 然後再過butanol洗N次
07/26 20:35, 11F
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07/26 20:36, , 12F
nuclease還是在那 你溫度一到就把DNA degrade給你看
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07/26 20:38, , 13F
另外RE的活性就是這麼強阿 現在不是有 5min RE在賣嗎
07/26 20:38, 13F
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07/26 20:57, , 14F
應該是說哪家的 RE star activity 這麼強吧...
07/26 20:57, 14F
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07/26 21:20, , 15F
我就說吧，是可以切很快的SphI 我沒有說哪一家喔 :)
07/26 21:20, 15F
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07/26 21:21, , 16F
我猜啦 我改用SacI/BamHI就沒事 一放SphI 稍微放久一點
07/26 21:21, 16F
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07/26 21:22, , 17F
就degrade惹
07/26 21:22, 17F
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07/26 21:53, , 18F
某家有做 SphI-HF，如果非用 SphI 不可的話，可以試試
07/26 21:53, 18F
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價格一樣，不過我沒有用過，搞不好這就是原苦主用的也說
07/26 21:53, 19F
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07/26 21:53, , 20F
不定wwwwww
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07/26 22:01, , 21F
不要咒我!!!我以為我不用再碰那個東西了!!
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07/27 00:36, , 22F
pu大,我覺得是SphI使用的buf剛好使得conta的nuclease好切
07/27 00:36, 22F
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07/27 00:37, , 23F
所以才會degrade,至少我用過SphI沒你講得這麼誇張
07/27 00:37, 23F
推
07/27 23:23, , 24F
FastDigest 的 EcoRI 切半個小時以上就有 star activity
07/27 23:23, 24F
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07/28 23:47, , 25F
我會先去跟別人借沒問題的gel extraction kit做做看，還有問題
07/28 23:47, 25F
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07/28 23:48, , 26F
再去查原因。
07/28 23:48, 26F
推
07/30 10:21, , 27F
我也不覺得是degrade 8K試著把elution buf 加熱到80度再
07/30 10:21, 27F
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07/30 10:23, , 28F
elute吧 不過puec2遇到的應該真的是degrade 有tail的話
07/30 10:23, 28F
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07/30 10:24, , 29F
另外*activity應該比較不會出現tail 而是出現雜band 因為
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07/30 10:25, , 30F
*act 該是Enz的specificity下降認錯mer的緣故 而不是什麼
07/30 10:25, 30F
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07/30 10:26, , 31F
DNA substrate都會切
07/30 10:26, 31F
推
07/30 10:28, , 32F
我還想問問樓上上問的FastDig EcoRI 半小時以上有*act的
07/30 10:28, 32F
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07/30 10:29, , 33F
是哪一家?? 我要避開 EcoRI是我的幸運cut site XDD
07/30 10:29, 33F
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[求救] gel extraction
a14743535
11年前, 03/19
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