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[求救] gel extraction

看板Biotech (生命科學)作者 (pig)時間11年前 (2013/03/19 19:55), 編輯推噓17(17推 0噓 82→)
留言99則, 12人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
各位大哥大姊好阿 我最近在做clone的實驗 已經將insert(900bp)成功接進yT&A當中 現在要大量培養 用兩個限制酶將insert切下再接入另外一個vector中 我取約1ug的plasmid進行RE digest(總反應體積20uL) 37度，2hr；70度水浴，10min，中止反應 全部load進 1% agarose gel跑DNA電泳 用bioman的kit進行gel extraction 用20ul EB進行回溶 問題來了我純化出來的濃度都很低(不超過5ng/uL) 甚至沒有...而且A260/280也不對 kit應該是沒問題 因為我用了別人借同樣的kit還有別牌的kit結果都一樣 喔對~我在離完酒精後會再放入60度的烘箱5~10min(不知道有沒有影響) 有沒有人知道怎麼會這樣@@ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.11.135.87
推
03/19 20:05, , 1F
我不知道你的kit有沒有寫 不過我用的kit上有說不要用加熱
03/19 20:05, 1F
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03/19 20:06, , 2F
法去酒精 但是我不知道為什麼就是了XD
03/19 20:06, 2F
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03/19 20:23, , 3F
我是因為抽mini的時候可以放烘箱
03/19 20:23, 3F
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03/19 20:24, , 4F
然後我想說最後面的步驟都一樣~那應該也可以放烘箱
03/19 20:24, 4F
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03/19 20:24, , 5F
就把他放進去了
03/19 20:24, 5F
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03/19 20:33, , 6F
可以請問h大是用那一家的嗎？
03/19 20:33, 6F
推
03/19 21:13, , 7F
烘箱應該是沒差
03/19 21:13, 7F
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03/19 21:15, , 8F
不過DNA binding和elute有等個幾分鐘再離心嗎?
03/19 21:15, 8F
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03/19 21:16, , 9F
先別問有多少,其實我很想問你認為純化出來的濃度應該多少？
03/19 21:16, 9F
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:17)
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03/19 21:18, , 10F
顯然這件事kit很無辜,是你沒有仔細想過濃度應該會多少
03/19 21:18, 10F
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03/19 21:18, , 11F
應該至少要有個10吧@@
03/19 21:18, 11F
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03/19 21:21, , 12F
好的像Q牌gel elution效率大概80%,若你只用20ul,怎麼有10？
03/19 21:21, 12F
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03/19 21:21, , 13F
回k大~我有等個幾分鐘才離心
03/19 21:21, 13F
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03/19 21:24, , 14F
呃...我用比例去估算的
03/19 21:24, 14F
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03/19 21:25, , 15F
load進去的總共是1ug DNA~recovery大概是60%的話
03/19 21:25, 15F
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03/19 21:26, , 16F
用50uL回溶應該可得到600ng的DNA~
03/19 21:26, 16F
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03/19 21:26, , 17F
那20uL應該有個240ng左右吧@@
03/19 21:26, 17F
※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:26) ※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:27)
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03/19 21:27, , 18F
換算成濃度就10左右~@@
03/19 21:27, 18F
補充一下~我有把兩個well的放在一起回溶過 ※ 編輯: a14743535 來自: 124.11.135.87 (03/19 21:36)
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03/19 22:11, , 19F
暈倒.....你是切1ug plasmid,非1ug的900bp吧
03/19 22:11, 19F
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03/19 23:16, , 20F
對
03/19 23:16, 20F
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03/19 23:18, , 21F
1ug的plasmid切出來的insert不是也應該是1ug嗎??
03/19 23:18, 21F
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03/19 23:24, , 22F
照你的算法光insert就有1ug，那就加上vector 2ug
03/19 23:24, 22F
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03/19 23:24, , 23F
這很有問題阿!! XD
03/19 23:24, 23F
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03/19 23:26, , 24F
請辜狗將bp換算成ug
03/19 23:26, 24F
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03/19 23:28, , 25F
1ug plasmid 切下來的怎麼會有 1ug?
03/19 23:28, 25F
推
03/19 23:29, , 26F
要粗略換算的V:I下去分1ug就可以了
03/19 23:29, 26F
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03/19 23:29, , 27F
假設vector包含900的insert有4K，1ug plasmid 拿去切，
03/19 23:29, 27F
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03/19 23:30, , 28F
哈哈哈~~我忽然發現我的這個數學有點白痴~~XD
03/19 23:30, 28F
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03/19 23:30, , 29F
900 bp 的片段只有會 1ug×(900/4000)= 225 ng 而已啊。
03/19 23:30, 29F
推
03/19 23:35, , 30F
所以你有沒有做接下來的實驗啊?
03/19 23:35, 30F
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03/19 23:36, , 31F
這種濃度常常都很低 因為用kit抽 我就直接ligation了
03/19 23:36, 31F
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03/19 23:37, , 32F
如果vector也有切過膠的話 有長有中
03/19 23:37, 32F
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03/19 23:39, , 33F
沒有耶~因為A260/280的值也很有問題
03/19 23:39, 33F
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03/19 23:39, , 34F
所以我就沒用@@
03/19 23:39, 34F
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03/19 23:41, , 35F
通常 GelEx 的 260/280 本來就會很難看，畢竟濃度很低。
03/19 23:41, 35F
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03/19 23:41, , 36F
一般來說用跑膠確認比較好，只要有 band 我都會不管
03/19 23:41, 36F
還有 23 則推文
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03/22 12:27, , 60F
一般用的EtBr靈敏度極限,再想想2ul看不看得到,若是3~500bp
03/22 12:27, 60F
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03/22 12:29, , 61F
同樣切1ug,連5~10ul也可能看不到,結果就是elute全拿來跑膠
03/22 12:29, 61F
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03/22 12:33, , 62F
前一個說跟ladder比亮度的就更扯了,ladder大概都25~50ng
03/22 12:33, 62F
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03/22 12:37, , 63F
如果原po也這樣比較,大概可ligate的,會以為elute失敗而丟掉
03/22 12:37, 63F
推
03/22 12:59, , 64F
婀~ 跑膠的靈敏度是ng 原po的例子已經足以看到~
03/22 12:59, 64F
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03/22 13:04, , 65F
EtBr大概5~10ng,內染又更慘,或是你覺得原po是用高級染劑
03/22 13:04, 65F
推
03/22 13:16, , 66F
5~10ng 所以原po的2ul足以看到~ 沒錯阿!
03/22 13:16, 66F
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03/22 13:26, , 67F
原po的濃度都低於5,取2ul是要挑戰機器的靈敏度
03/22 13:26, 67F
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03/22 13:28, , 68F
而且今天做的是300~500或200bp的miRNA,那2ul跑膠不就更慘
03/22 13:28, 68F
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03/22 13:32, , 69F
跑膠可以確認,但不少人都把可往下做的東西,膠沒看到就丟了
03/22 13:32, 69F
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03/22 13:34, , 70F
這類文板上也不少,都是小片段跑膠看不到就歸罪kit純化失敗
03/22 13:34, 70F
推
03/22 13:54, , 71F
事實上依經驗,EtBr可以看到更少的量,2~3ng都還可以~
03/22 13:54, 71F
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03/22 13:55, , 72F
做ligation,你勢必要知道insert的量,方法不外乎就是
03/22 13:55, 72F
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03/22 13:55, , 73F
1.測OD 2.跑膠 這兩種方法所需的體積幾乎是一樣的
03/22 13:55, 73F
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03/22 13:56, , 74F
大約都是1~2ul就可以~ 因此沒有所謂全拿來跑膠的問題~
03/22 13:56, 74F
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03/22 13:58, , 75F
而跑膠可以獲得的資訊,比純測OD要多~
03/22 13:58, 75F
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03/22 13:58, , 76F
其實測nanodrop濃度不到10，也可能一跑膠就看得到band喔
03/22 13:58, 76F
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03/22 13:58, , 77F
簡單的說取2ul跑膠看不到那你應該很難接上，就這麼回事
03/22 13:58, 77F
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03/22 13:58, , 78F
你可以知道size,可以知道大概的量~ ligation只要知道大約
03/22 13:58, 78F
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03/22 13:59, , 79F
即可~ 我的經驗也跟hunban大一樣~
03/22 13:59, 79F
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03/22 14:02, , 80F
以我最近做的200+3k, 切1ug,照原po的條件,濃度只有1.5ng/ul
03/22 14:02, 80F
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03/22 14:04, , 81F
但就算是200+7k的pLKO,濃度連1ng都不到,ligation也很好做
03/22 14:04, 81F
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03/22 14:05, , 82F
小片段濃度很低本來就很正常,沒有濃度低就接不起來這回事
03/22 14:05, 82F
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03/22 14:09, , 83F
像ligation時200bp拿1ng,2kb就要20ng,就molar比ng更重要
03/22 14:09, 83F
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03/22 14:12, , 84F
以跑膠或測OD眼睛想看到ng來評估ligation成功是很不恰當的
03/22 14:12, 84F
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03/22 14:14, , 85F
因為小片段看不到不代表失敗,反之大片段看得到卻代表會失敗
03/22 14:14, 85F
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03/22 14:17, , 86F
iceking講出重點了,知道size計算最重要,測OD跟跑膠都可省略
03/22 14:17, 86F
推
03/22 14:17, , 87F
跑膠只是求心安 O/N時比較睡的著XDD
03/22 14:17, 87F
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03/22 14:18, , 88F
濃度大小自己算一算就知道跑膠到底看不看的到
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03/22 14:19, , 89F
測OD部分反而比較要注重dna品質(260/280 260/230)
03/22 14:19, 89F
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03/22 15:25, , 90F
可省略一樣做得出是沒錯,但這是偷吃步,實驗還是要拿得出
03/22 15:25, 90F
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03/22 15:26, , 91F
證據~ 我講的是比較規矩的做法罷了. 260/280在此時其實
03/22 15:26, 91F
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03/22 15:27, , 92F
比較不具參考價值了,因為錯誤率太大~
03/22 15:27, 92F
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03/22 15:29, , 93F
我知道後面成功,就代表過程沒問題了,只是過程的確認在科學
03/22 15:29, 93F
→
03/22 15:29, , 94F
裡面也是很重要的~
03/22 15:29, 94F
推
03/22 15:31, , 95F
看後面ligation是哪一種吧?sticky跟TA哪種就不要求
03/22 15:31, 95F
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03/22 15:32, , 96F
blunt end就龜毛了....
03/22 15:32, 96F
推
03/23 19:28, , 97F
知道哪裡可以省略也是一種know-how阿~
03/23 19:28, 97F
推
03/23 19:30, , 98F
要用到跑膠等等方式都是用來trouble shooting的
03/23 19:30, 98F
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04/17 13:44, , 99F
如果沒有, 你後面transform到天荒地老也不會有clone的.
04/17 13:44, 99F
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