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[求救] QPCR primer設計及PCR檢測

看板Biotech (生命科學)作者時間10年前 (2015/01/29 12:19), 10年前編輯推噓10(10推 0噓 22→)
留言32則, 7人參與, 最新討論串1/1
標題: [求救] QPCR primer設計及PCR檢測 時間: Thu Jan 29 12:19:48 2015 事情是這樣的 把之前學長設計的 QPCR primer 拿去跑 PCR (以cDNA作為模板) 結果發現有些 primer 的夾出的基因片段很模糊, 有 dimer 或是夾不出來目標片段 老師希望我重新設計引子對,而學長當初是以老師給他的序列 (200-500bp)(早期片段,來源 不明) 來設計引子 因為之後可能會進行 RNAi 的實驗, 所以可能需要更長的片段 所以我就拿之前老師給學長的序列拿去 NCBI 做 Blastn 對應到的第一名的序列 Query cover, identity 趴數都很高, 而 E-value 也都很趨近於 0,物種相同,片段長度都有 1000bp 以上 將這些序列送至 Primer Expression 軟體進行引子設計(Tm值設定為 58-60度C, primer 長度為 9-40bp,GC content為 30-80%...etc) 跑出來的 primer 有五十名, 但因為前面名次的 primer 會有hairpin, dimer 或 cross dimer, 所以我會往下挑選 可是最後跑出的卻夾到許多非目標的大片斷或不明顯 下圖為 PCR 膠圖結果 http://imgur.com/IQYc9sm
第一個 well 是 housekeeping gene 做對照的 其他的為我設計的基因 primer, 一個基因 load 兩個well 第一行字為基因名稱, 第二個為 annealing 溫度, 最底下那排為預期長度片段 跑出來好糟糕QQ 還是真的是我太雖 挑到的primer都很差... 懇請版上大大指教與挑錯plz -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.189 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1422505191.A.72E.html ※ 編輯: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 12:20:36
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01/29 13:22, , 1F
其實不算很糟糕,其實文章第三句用QPCR primer的片段很模糊
01/29 13:22, 1F
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01/29 13:25, , 2F
就猜想你應該忽略band的清晰度取決於膠的濃度與片段大小
01/29 13:25, 2F
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01/29 13:32, , 3F
忘了說明我使用的是2% TAE 可是做對照的基因都很明顯
01/29 13:32, 3F
※ 編輯: zodiac123 (140.112.4.189), 01/29/2015 13:33:35
推
01/29 13:48, , 4F
建議啦.長度過300就不要了 exon-exon的話1-200就好了
01/29 13:48, 4F
推
01/29 13:49, , 5F
再來不不知未來你一盤要跑幾個基因 不過pcr階作個gradient
01/29 13:49, 5F
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01/29 13:50, , 6F
比較能清楚哪個primer比較好用 建議都跑一次找個最佳化
01/29 13:50, 6F
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01/29 13:51, , 7F
最後一點 你這gene只有一個transcript??量??
01/29 13:51, 7F
推
01/29 13:54, , 8F
因為你放的b-tub 我覺得光看semi qPCR的感覺..他的量好像
01/29 13:54, 8F
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01/29 13:54, , 9F
沒有很高耶Q_Q 是用induce後回收再轉的cDNA嗎?
01/29 13:54, 9F
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01/29 13:55, , 10F
不過我覺得最後一個還不錯啊@_@?
01/29 13:55, 10F
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01/29 14:33, , 11F
最後一個可能是唯一可以忍受的...我要被老師罵慘了QQ
01/29 14:33, 11F
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01/29 14:34, , 12F
cDNA是直接以活體抽RNA後RT
01/29 14:34, 12F
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01/29 14:35, , 13F
之後我還會再提高annealing溫度跑一次
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01/29 14:39, , 14F
到底為何會夾到大片段QQQQQ
01/29 14:39, 14F
推
01/29 15:35, , 15F
跟pcr和pol有關啊.好的pol 72度跑個20秒就一堆500bp以上了
01/29 15:35, 15F
推
01/29 20:10, , 16F
01/29 20:10, 16F
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01/29 20:11, , 17F
用primer blast確認一下會不會p到其他東西
01/29 20:11, 17F
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01/29 20:12, , 18F
如果你的物種不會太罕見的話
01/29 20:12, 18F
推
01/29 21:26, , 19F
感覺你大片段非專一黏合的比目標多，不夠專一?
01/29 21:26, 19F
推
01/30 08:45, , 20F
等等 預期長度片段只有60bp?
01/30 08:45, 20F
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01/30 08:51, , 21F
amplicon我會挑100bp上下 讓它跟primer dimer比較好區分
01/30 08:51, 21F
推
01/30 16:41, , 22F
上面講的都對,如果接下來要做qPCR,你的Tm直接抓65度
01/30 16:41, 22F
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01/30 16:43, , 23F
上下,50~60度那是一般PCR再用的.如果要用PCR確認引
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01/30 16:47, , 24F
子是否能用,Taq別用HiFi的會做出亂七八糟的東西
01/30 16:47, 24F
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01/30 16:49, , 25F
你的PCR產物那麼短,跑的膠改用4%吧,ladder看有沒有
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01/30 16:50, , 26F
50bp或25bp的能用,100的實在看不出來.
01/30 16:50, 26F
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01/30 16:51, , 27F
最後既然primer都合出來了,乾脆直接上qPCR跑一個樣
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01/30 16:52, , 28F
本,然後看anneling curve最快惹~
01/30 16:52, 28F
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01/30 16:59, , 29F
另外,primer設計的部分我會習慣3'用G或C結束
01/30 16:59, 29F
推
01/30 17:08, , 30F
原Po 鳥松 吳尊推
01/30 17:08, 30F
推
01/30 17:32, , 31F
長度那麼小 用qpcr機器跑個melting比較快
01/30 17:32, 31F
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01/31 15:12, , 32F
謝謝各位大大的回答 有結果再回報給大家
01/31 15:12, 32F
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