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[求救] t a clone 問題

看板Biotech (生命科學)作者 (獨孤求敗)時間10年前 (2015/04/28 11:30), 編輯推噓11(11推 0噓 25→)
留言36則, 9人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
t a clone 實驗步驟 請教各位前輩 insert 1700bp 使用yeastern t and a vector 2728 bp rt-pcr 產物 切膠 萃膠 開始做a tailing(使用phire 的tag ) 5x GC buffer 6ul 2.5mM DATP 3ul dna 含量 20ul 72c 30m, 12 overnight phire 1ul 之後在使用 QIA quick pcr purifcation kit 純化後 檢測核酸的含量 OD value 約在35-55 ug/ml ligation(使用biolabs t4 ligase) ta vector 2(50ng) t4 ligase 2 dna 3(150/55) 16 度 overnight dw 補到20 t4 ligase 2 之前有測試過1:3 mole 1:3 1:5 重量比 發現在重量比的箘長的比較好 之前學姐也是如此 所以一直都是使用重量比 莫爾數比的箘很少 選用dh5-a competent cell 接5ul 增箘1.5hr 塗盤（lb+amp 100mg/ml ） 隔日進行colony pcr 選用13f+自行的primer colony pcr 結果在目標的產物有很淺很淺的band 要肉眼看膠片才看得出來 但抽完plasmid 定序發現都沒有insert 進去 每次定序都是vector 箘長的50 個菌落以上（塗盤使用65ul） 但似乎都沒有insert 進去 想請教前輩 要如何知道是a tailing 成功？ 不然每次都重做一次很耗時 （我有大量的樣本） 我有請學姊跟我一起操作過 確認實驗技術沒有問題 用別的樣本也有成功 但是這一段就還沒有成功 卡關快半年了 覺得心灰意冷 想請問各位前輩有什麼要改進的地方？ 若我實驗成功一定大大的感謝你 若你離我很近 請讓我請你喝新巴克QQ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.4.190 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1430191831.A.6B2.html
推
04/28 11:58, , 1F
blunt end PCR產物推薦用pjet1.2 vector,很好用
04/28 11:58, 1F
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04/28 12:04, , 2F
你的insert或vertor，得至少有一個5'-end有phosphate group
04/28 12:04, 2F
推
04/28 12:04, , 3F
A tailing taq處理 72c 3hr
04/28 12:04, 3F
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04/28 12:09, , 4F
另外，抽完 Plasmid 怎麼會直接拿去定序呢？跑個膠先看看才
04/28 12:09, 4F
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04/28 12:09, , 5F
對啊。你insert：vector很接近，在膠體上很容易分辨出來的。
04/28 12:09, 5F
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04/28 12:14, , 6F
還有，你在 ligation 步驟中，加了多少 ligase？
04/28 12:14, 6F
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04/28 12:17, , 7F
要不然就是使用會在 3'-end 自動加 a-tail 的 polymerase
04/28 12:17, 7F
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04/28 12:24, , 8F
對了，也有可能是 ligase 的問題。ligase 非常 labile，以前
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04/28 12:29, , 9F
實驗室剛買來，就先用冰的tube分裝4或5λ，編號冰起來，依序
04/28 12:29, 9F
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04/28 12:31, , 10F
從-20℃取出使用。
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04/28 12:36, , 11F
還有，ligase處理完，可以用65或72℃處理5 min……
04/28 12:36, 11F
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04/28 12:38, , 12F
最後，OD value 它就不會是濃度單位。你的敘述要再修改。
04/28 12:38, 12F
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04/28 13:14, , 13F
這個protocol好奇怪,你有大量樣本更不需這麼麻煩的作法
04/28 13:14, 13F
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04/28 13:16, , 14F
直接用pJET那套就省事多了
04/28 13:16, 14F
推
04/28 14:49, , 15F
有錢買topo啊 QwQ
04/28 14:49, 15F
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04/28 17:14, , 16F
回ICE9前輩 我加了2ul ligase，想請教抽完plasmid 跑膠是
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04/28 17:16, , 17F
是用酵素re切跑膠麻？還有謝謝od的指正，我想表達的是濃
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04/28 17:19, , 18F
度的部分，我使用的是pfu tag 所以需要加a tailing
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04/28 17:22, , 19F
那我要怎麼確定我的產物端有磷酸化？ 謝謝前輩
04/28 17:22, 19F
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04/28 17:25, , 20F
回williamyang blence 謝謝你的建議 因為這一方面的經驗
04/28 17:25, 20F
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04/28 17:26, , 21F
驗沒有很多 我會好好研究一下 謝謝你們
04/28 17:26, 21F
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04/28 17:58, , 22F
文中沒提,你的colony沒有藍白挑過？
04/28 17:58, 22F
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04/28 19:33, , 23F
回blence前輩 沒有 實驗室學姊的步驟就是我上面步驟的
04/28 19:33, 23F
推
04/29 09:18, , 24F
PCR product 50ng/ul 取1ul跑膠 不會只有很淡的band
04/29 09:18, 24F
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04/29 09:19, , 25F
或許你的產物不夠專一
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04/29 09:23, , 26F
咦 我漏看了 怎不做藍白篩呢？
04/29 09:23, 26F
推
04/29 17:46, , 27F
設計跨vector inser 的primer 做colony PCR 不然就藍白篩
04/29 17:46, 27F
推
04/29 17:51, , 28F
其實ligation完可以先PCR看看是否有接進去
04/29 17:51, 28F
推
04/29 18:22, , 29F
同步做先前成功的樣本 當做整個過程的postive control
04/29 18:22, 29F
推
04/29 18:44, , 30F
如果RT-PCR完的產物只有1種or目標產物最多 直接clean up
04/29 18:44, 30F
推
04/29 18:55, , 31F
甚至Pfu完直接加1ul taq 做3'端的A之後再clean up(要試)
04/29 18:55, 31F
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04/29 18:57, , 32F
跑膠切膠的步驟應該是可以省略的
04/29 18:57, 32F
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04/29 18:59, , 33F
很淡的band應該都是偽陽性 猜primer沒有跨vector& inser
04/29 18:59, 33F
推
04/29 19:08, , 34F
沾菌的時後取到微量塗盤時的linear vector
04/29 19:08, 34F
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05/01 16:51, , 35F
回前輩chaunen 謝謝你的建議 我會先ligation 跑跑看
05/01 16:51, 35F
推
05/01 22:47, , 36F
要不要試試用kinase處理insert
05/01 22:47, 36F
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