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[求救] TA cloning相關問題

看板Biotech (生命科學)作者 (明智)時間10年前 (2015/07/27 19:08), 編輯推噓8(8推 0噓 35→)
留言43則, 11人參與, 最新討論串1/3 (看更多)
我是借用朋友帳號po文的...謝謝 小妹我先用Taq p出我要的片段約650 np，然後照invitrogen的TOPO TA Cloning附的prot ocol進行ligation:取1 ul的PCR產物及2 ul的pCR2.1 vector作用室溫1 hr，接著做trans formation用藍白篩，結果有長白的colony也有藍的，我挑白的做mini-prep再用EcoRI 切 我抽的DNA後，完全切不到我要的片段...就像insert根本沒接進去ㄧ樣...但沒接進去的話c olony的顏色怎麼會是白的勒？ 所以我想請問各位大大 是否可以告知我是哪邊實驗出問題了勒？謝謝大家～ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 223.142.85.250 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1437995336.A.CF1.html
推
07/27 21:16, , 1F
哪隻Taq? 有純化? 用了topo接不出來 經費表示傷心
07/27 21:16, 1F
推
07/27 22:09, , 2F
plat是新鮮的嗎？
07/27 22:09, 2F
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07/27 23:36, , 3F
沒照protocol時間;沒純化產物;反應比例也不適合
07/27 23:36, 3F
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07/28 17:20, , 4F
先看過protocol唄...
07/28 17:20, 4F
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07/28 23:10, , 5F
我記得還有一罐鹽要加?
07/28 23:10, 5F
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07/29 00:46, , 6F
plate是新鮮的沒錯唷～ 另外，protocol上沒說PCR產物需
07/29 00:46, 6F
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07/29 00:46, , 7F
要純化後再進行ligation所以沒純化，再來比例問題vector
07/29 00:46, 7F
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07/29 00:46, , 8F
下的量是照protocol上寫的下，產物建議用量是0.5-1 ul
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07/29 00:46, , 9F
所以我下1ul，不知道b大指的是哪邊有問題呢？ 如果我有
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07/29 00:46, , 10F
哪邊認知錯誤歡迎告知唷！謝謝～
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07/29 00:54, , 11F
PCR產物裡面一堆雜七雜八的東西
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07/29 00:54, , 12F
直接拿去ligation 當然會接到一堆雜七雜八的東西囉!!
07/29 00:54, 12F
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07/29 01:20, , 13F
既然原po也看protocol,應該也有看到pCR2.1用多少,時間多長
07/29 01:20, 13F
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07/29 01:28, , 14F
protocol也說你的band不是唯一或很乾淨,應該需要gel純化
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07/29 01:46, , 15F
vector不管2.1或II都建議用1ul,怎麼你的protocol會不同？
07/29 01:46, 15F
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07/29 11:33, , 16F
PCR完的那一管很髒的，ligase 很脆弱。你應該先從很基本的原
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07/29 11:34, , 17F
理(大致的)開始學，而不是一上來就用 kit，我覺得這是貴實驗
07/29 11:34, 17F
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07/29 11:35, , 18F
的問題。另外，藍白篩會出錯很正常啊～～更何況你没純化產物
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07/29 13:57, , 19F
原po用topo啦,不是普通人用ligase等級的
07/29 13:57, 19F
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07/29 17:47, , 20F
唉，原PO抱歉了。感謝 blence 指正。
07/29 17:47, 20F
推
07/29 21:54, , 21F
冰9也沒人說你錯啊...原po沒純化就上topo 接到雜的只能說t
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07/29 21:54, , 22F
opo真的貴又強 什麼都能接 XD 試問: 皇帝豆跟小米粥哪
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07/29 21:54, , 23F
個比較好吞?? 要嘛我也吞小米粥(小雜band) 才不想吃皇
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帝豆(目標產物) 噎死自己
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推
07/29 21:56, , 25F
而且...讓新手用topo的lab..說不定都用Phusion而不是普通T
07/29 21:56, 25F
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07/29 21:56, , 26F
aq..原po沒說是用哪個 嗯...
07/29 21:56, 26F
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07/30 00:30, , 27F
內文已經說Taq了,講Phusion會不會讓人誤會它是昂貴的Taq？
07/30 00:30, 27F
推
07/30 04:49, , 28F
也是 囧a 所以其實正確解是找售後??
07/30 04:49, 28F
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07/30 12:16, , 29F
老實說我覺得藍白挑是非常沒有效率的，原 PO 可以試試
07/30 12:16, 29F
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07/30 12:17, , 30F
colony PCR，可以不用一直抽 mini 就挑到有正確接上的
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07/30 12:17, , 31F
菌。
07/30 12:17, 31F
推
07/30 12:39, , 32F
找個熟colony的一對一現場教學最快, 或直上他的protocol.
07/30 12:39, 32F
推
07/30 15:16, , 33F
藍白篩真的很沒效益,而且會有偽陽性的問題
07/30 15:16, 33F
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07/31 01:06, , 34F
謝謝各位大大回答我的疑問～其實我的band P完之後是沒
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07/31 01:06, , 35F
有雜band的，有也是在約3 kb的位置有很淡的ㄧ點點，但想
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07/31 01:06, , 36F
說大的片段應該接不進去所以就沒純化了！不知道我的認
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07/31 01:06, , 37F
知是否有誤？
07/31 01:06, 37F
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07/31 01:08, , 38F
謝謝cxtomnyxx大！你的colony PCR我會查一下並跟實驗室
07/31 01:08, 38F
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07/31 01:08, , 39F
的學長姐討論看看的謝謝～
07/31 01:08, 39F
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07/31 01:56, , 40F
非常不建議做colonyPCR阿,它又不能解決偽陽性問題
07/31 01:56, 40F
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07/31 01:57, , 41F
如果做cloning常失敗,應該是去改善成功率,降低偽陽性才對
07/31 01:57, 41F
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07/31 02:13, , 42F
畢竟colonyPCR試完還是要mini,何必多此一舉又沒效益
07/31 02:13, 42F
推
07/31 09:53, , 43F
colonyPCR就是大筆撒下去 理論上topo應該比較不需要吧
07/31 09:53, 43F
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