Re: [求救] IP的方法測Protein的ubiquitination

看板Biotech (生命科學)作者patricksky (江伯)時間9年前 (2015/12/04 22:57)推噓0(0推 0噓 0→)

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IP中重要的是抗體的使用，文章有些說的不是很清楚，所以我想確認一下 ※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之銘言： : 各位版友大大前輩們好 : 小弟最近實驗想探討在乳癌細胞中某non-coding RNA對於其 : Target protein ubiqutination的影響 : 看paper幾乎都是以IP的方式來做 : 原理大致上是把Target protein用抗體抓下來後 : 然後在western上用Ub的antibody來做hybridization 你這邊的抗體是只認Ub tag 還是 Ub 後的target protein? : 所以小弟我的實驗設計也是仿照paper的模式 : 在MCF-7細胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 : 隔天在收細胞前先以MG132(20uM)處理4h(也是參考paper的條件) : 然後把細胞收下來後開始進行IP的實驗你實驗中是否有用到anti target-protein antibody ? 你的anti target-protein antibody是否可以在一般western下認到專一性的band 並且大小是你要的protein? 這抗體是否能同時認到 Ub-target protein? 過量表現或是抑制表現條件下的WB 此抗體是否能準確偵測到Ub-target protein or target-protein 的量上升或下降? : 我的實驗流程如下 : 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反應30min(每5min vortex 10s)，然後離心後取 : 上清液 : 2.Protein定完量後，固定為800ug protein為一個IP，總體積200ul，並留80ug protein : 作為Input(先煮好，保存於-80) : 3.先讓Protein和G bead反應約6h，把會和G bead結合的protein分離出來 : 4.把剩下沒和G bead結合的protein加入抗體(1:100)，4度C反應Overnight 上面有提到你的WB是認Ub的antibody 推論你這邊應該用anti target-protein antibody ? : 5.隔天把G bead加進去，也是4度C反應Overnight : 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分離出來，用wash buffer洗三次5min : 7.加入sample buffer後煮10min : 8.Western blot 詳細的1抗2抗能否提供? : 然後現在結果出來了不太理想，有幾個問題 : 1.看paper Ub-protein沒有只是單一條band而已，譬如我的target protein分子量在43kD : ，理論上來說它在接上Ub後band會出現在43kD的上方連續好幾條band，但是我的結果似乎 : pattern沒有和paper那麼像，只有兩條band，位置出現在50kD和70kD附近你做的protein和paper是同一顆? 另外感覺你這邊似乎沒做過量表現該Ub-蛋白質之前和之後的一般WB 不然應該已經先確認過該Ub-蛋白質大小才對，直接跳到IP不太妥當先確認你的細胞過量表現前後的WB，先看看你的蛋白質的大小及分布萬一你蛋白質的一般WB 跟你的IP後的WB 大小完全不一樣... 就會有是否真的抓到同一顆蛋白質的疑慮... : 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的雜band，而且有兩條也在我預計想看的 : protein相同位置上能否詳細說明下你的Negative control是拿甚麼東西做呢? 一般細胞? 不表現該蛋白質的細胞? 不過既然有雜band的話，理論上你的實驗組應該也要有雜bands才對... 有可能就是單純的Negative control汙染或是沒洗乾淨... 另外可以多做一個WB測試你的pellet有無actin 或 tublin 或其他house-keeping genes 看看你是否每組實驗組和控制組都有洗乾淨，有可能會發現Negative control沒洗乾淨，而實驗組有洗乾淨 : 跟老師和學長姐討論之後，認為那些band都不是我要看的，簡單來說就是有可能我的 : Ab沒有成功把target protein抓下來 : 目前我想到的解決方式有幾個 : 1.先用WB測試我的target protein 有沒有被Ab抓下來 : 2.提高IP反應Protein的量 : 3.外送Ub plasmid : 想請問各位大大們還有甚麼其他意見嗎??? 感激不盡~ 可以多放一組一般細胞和過量表現的細胞的控制組說明你的蛋白質bands是哪幾條 IP有時候會抓到奇奇怪怪的東西，也許是新的研究方向? 以上參考 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 119.14.51.170 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1449241064.A.6A4.html