Re: [求救] IP的方法測Protein的ubiquitination

看板Biotech (生命科學)作者fentanyl945 (fentanyl)時間9年前 (2015/12/04 23:53)推噓0(0推 0噓 0→)

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補充一些可以考慮的點 ※ 引述《shinchenboy (欣承男孩)》之銘言： : 各位版友大大前輩們好 : 小弟最近實驗想探討在乳癌細胞中某non-coding RNA對於其 : Target protein ubiqutination的影響 : 看paper幾乎都是以IP的方式來做 : 原理大致上是把Target protein用抗體抓下來後 : 然後在western上用Ub的antibody來做hybridization 同前一篇 patricksky 大及其他人所言你有用過這抗體先測試做 IP 或 WB 嗎? 理想狀態下你應該要有兩隻對你的目標蛋白質具專一性且能用在 IP 與 WB 的抗體然後拿一隻來做 IP 另一隻做 WB : 所以小弟我的實驗設計也是仿照paper的模式 : 在MCF-7細胞建立Over-expression ncRNA及Control的Model後 : 隔天在收細胞前先以MG132(20uM)處理4h(也是參考paper的條件) MG132 的使用需小心首先 MG132加到培養基中會立刻結晶沉澱要注意搖勻的問題其次你有沒有做濃度與時間曲線找出最適合你實驗的處理條件最後對某些蛋白質而言加入 MG132反而會改變其表現 : 然後把細胞收下來後開始進行IP的實驗 : 我的實驗流程如下 : 1.先以RIPA buffer(sigma)冰上反應30min(每5min vortex 10s)，然後離心後取 : 上清液你有沒有加入 de-ubiquitinylating inhibitors? 例如 NEM, IAA, PR619等沒加的話 Ub 會在實驗過程中喪失你預期的 band 會消失 : 2.Protein定完量後，固定為800ug protein為一個IP，總體積200ul，並留80ug protein : 作為Input(先煮好，保存於-80) : 3.先讓Protein和G bead反應約6h，把會和G bead結合的protein分離出來 : 4.把剩下沒和G bead結合的protein加入抗體(1:100)，4度C反應Overnight : 5.隔天把G bead加進去，也是4度C反應Overnight 抗體與 beads 間有沒有做 cross-linking? 特別是你的蛋白質與泛素化後的蛋白質分子量是在一個尷尬的位置 IP 後如果抗體跟著蛋白質一起被洗出 WB 時你就會看到抗體的 band 了 : 6.隔天用磁座把G bead-Ab-protein complex分離出來，用wash buffer洗三次5min 你的 wash buffer 是什麼? 夠不夠 harsh? 這裡需要一個夠 harsh 的 wash buffer 把所有非專一結合的雜質蛋白質全洗出去只留下你與抗體穩定結合的目標蛋白質但要這樣做前提是你務必要做 cross-linking : 7.加入sample buffer後煮10min : 8.Western blot : 然後現在結果出來了不太理想，有幾個問題 : 1.看paper Ub-protein沒有只是單一條band而已，譬如我的target protein分子量在43kD ~~~~~~~~~ 這在說什麼? : ，理論上來說它在接上Ub後band會出現在43kD的上方連續好幾條band，但是我的結果似乎 : pattern沒有和paper那麼像，只有兩條band，位置出現在50kD和70kD附近 : 2.我的Negative control抓到很多很奇怪的雜band，而且有兩條也在我預計想看的 : protein相同位置上同 patricksky 所問, Negative control 是什麼? 你有沒有同時跑兩片 WB? 一片用你手上有專一性, 可辨認目標蛋白質的抗體跑另一片用可辨認 Ub 的抗體如 FK1, FK2, P4D1 染再來交叉比對 band 的位置就可以推論出哪些 band 是有 Ub 的 band : 跟老師和學長姐討論之後，認為那些band都不是我要看的，簡單來說就是有可能我的 : Ab沒有成功把target protein抓下來 : 目前我想到的解決方式有幾個 : 1.先用WB測試我的target protein 有沒有被Ab抓下來基本一定要做的 : 2.提高IP反應Protein的量不預期會有效果 : 3.外送Ub plasmid : 想請問各位大大們還有甚麼其他意見嗎??? 感激不盡~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 162.129.251.85 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1449244433.A.B72.html