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[求救] Flow cytometry protocol(FITC)

看板Biotech (生命科學)作者 (x-ray)時間9年前 (2016/03/11 18:40), 9年前編輯推噓14(14推 0噓 21→)
留言35則, 9人參與, 最新討論串1/1
各位大大好 小弟第一次接觸FLOW 使用的機器是BD FACSCalibur Flow Cytometry 想做經過我transfect基因後 想看細胞表面的抗原表現 有幾個想請教大家 上機之前細胞的處理 1.blocking方面大家是如何做的 我們實驗室之前學姊protocol是寫0.5 BSA/PBS 1hr 可是上網爬文,許多人好像都是用酒精? 2.一抗和二抗 我知道有直接下一次抗體(帶有FITC or PE)就可以上機的抗體 可是我做的blood group好像沒有可以直接下一次抗體 所以我是下完一抗1hr 0.5%BSA/PBS washX3 在下二抗帶有FITC(確定沒有加錯二抗) 3.FLOW機器的操作 做三次每次的X-FSC Y-SSC的圖都不是像大家的微笑曲線 然後X-FITC Y-Count 的圖 peak都沒shift(positive ctrl) 而且跑WB 是確定有transfect gene進去的 希望版上大大能幫解惑~~ 感謝 補圖 http://imgur.com/TxcZ7OV.jpg
-- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.72.94 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1457692814.A.E10.html
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03/11 19:42, , 1F
有圖可看嗎
03/11 19:42, 1F
我人在外面，晚點回去補圖 ※ 編輯: tony51501 (27.247.22.65), 03/11/2016 20:21:41 ※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:02:30 ※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:09:48
推
03/11 23:53, , 2F
1. blocking用酒精?你一定是誤會了什麼事情
03/11 23:53, 2F
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03/11 23:55, , 3F
2. 就操作來說沒問題
03/11 23:55, 3F
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03/11 23:55, , 4F
3. 你的細胞是不是死一堆不健康還是一堆碎片阿?
03/11 23:55, 4F
我收細胞是用trypsin->PBS wash->0.5%BSA blocking 之後都放冰上而且離心機也都調4度C(1500rpm 5min) 我有問其他實驗室學姊他也說我的細胞狀況很差 我也不知道為什麼死那麼多QQ
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03/11 23:56, , 5F
另外能跑western blot的抗體不一定能用來看flow
03/11 23:56, 5F
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03/11 23:57, , 6F
一個是看denature protein一個是有3/4級結構的阿
03/11 23:57, 6F
我們老闆買的一抗 http://www.biolegend.com/anti-bg-4-antibody-11016.html 這種一抗需要避光嗎?
推
03/12 00:39, , 7F
建議你可以從原廠的操作步驟開始研究，之後修正你的操作
03/12 00:39, 7F
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03/12 00:39, , 8F
步驟
03/12 00:39, 8F
推
03/12 00:43, , 9F
可參考這個http://goo.gl/L8yEbw
03/12 00:43, 9F
已閱!!感謝
推
03/12 00:56, , 10F
通常初學有人帶吧 問學長姐比較快
03/12 00:56, 10F
推
03/12 01:05, , 11F
冏, 原來是血型...
03/12 01:05, 11F
有人帶~~只是在上機後的資料判讀帶的人不太會QQ 我也是去查很多資料像是'mark' 'gate' 'mean' 'geo mean'需要看哪個以及代表的意義
推
03/12 02:12, , 12F
no-gate.... 先把ssc/fsc 左下角的渣渣們去掉
03/12 02:12, 12F
推
03/12 11:10, , 13F
WB跟flow是看同一個蛋白質嗎?確認有送進去跟你細胞有改變(
03/12 11:10, 13F
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03/12 11:10, , 14F
flow要看的表面抗原有表現)可能會是兩件事喔~
03/12 11:10, 14F
不知道什麼樣的gate才是最好的,是gate微笑曲線嗎? WB我是壓帶有tag的plasmid,flow則是抓細胞表面的antigen,希望我的一抗是有work的 ※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 11:54:23
推
03/12 12:20, , 15F
一抗是ihc的 不代表可以做FLOW唷
03/12 12:20, 15F
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03/12 12:21, , 16F
看起來是沒有螢光表現
03/12 12:21, 16F
好的,我也正想跟我們老闆討論看看!! ※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 13:34:58
推
03/12 14:33, , 17F
gate是要找你主要細胞群圈選出來 你fsc跟ssc上機時要不要
03/12 14:33, 17F
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03/12 14:33, , 18F
調小一點 因為點圖右邊那群被切一半的細胞會不會才是你要
03/12 14:33, 18F
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03/12 14:33, , 19F
看的細胞??
03/12 14:33, 19F
已經調最小了欸QQ，還是要把電壓調E-00我忘記是什麼可是好像可以縮小觀察細胞
推
03/12 23:05, , 20F
應該還是找的到flow能用的抗體, 另外也許要是有個對照組
03/12 23:05, 20F
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03/12 23:07, , 21F
應該可以幫助找到條件...抽點血之類的XDD
03/12 23:07, 21F
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03/12 23:08, , 22F
eBioscience有同樣的clone有加螢光但一樣沒說是否Flow可做
03/12 23:08, 22F
好的，我再找找試試看
推
03/13 15:54, , 23F
感覺有大部分沒染到 可以了解一下在螢光0以下的細胞比例
03/13 15:54, 23F
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03/13 15:55, , 24F
來檢視染色效果 若不佳 可換二抗看看 在換一抗試試
03/13 15:55, 24F
嗯嗯，那要花一些時間test了！ ※ 編輯: tony51501 (27.247.6.19), 03/13/2016 23:11:44
推
03/14 00:22, , 25F
你先試run個PI stain. 抓到感覺再跑你的sample
03/14 00:22, 25F
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03/14 00:24, , 26F
btw 要看表現 直接細胞染色看IFA會不會簡單點
03/14 00:24, 26F
好的，我查查看或問人怎麼做好了！謝謝你 對了，染P I不是看cell cycle的狀況嗎？然後我現在做應該就是indirect吧？
推
03/14 09:04, , 27F
如果你現在是用E01 數值也無法再調小 那要變小的確是改
03/14 09:04, 27F
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03/14 09:04, , 28F
成E00沒錯 然後再調整數值至欲觀察細胞群"位在畫面中間且
03/14 09:04, 28F
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03/14 09:04, , 29F
成群" 加油~
03/14 09:04, 29F
我好像是用E00，有試過改成E-1，調整以後可以像微笑曲線，這樣不知道可不可以，謝謝 你！ ※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 14:50:43 ※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 15:23:10
推
03/14 21:52, , 30F
重點是有看到細胞 電壓值跟你細胞大小有關 沒有標準答
03/14 21:52, 30F
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03/14 21:52, , 31F
案
03/14 21:52, 31F
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03/14 21:54, , 32F
你有沒有Positive control 就是必定會染上的組別?
03/14 21:54, 32F
有做但是效果好像沒有很好，我再想是不是我細胞的問題，可是繼代存活率有96%說Q Q ※ 編輯: tony51501 (27.246.200.215), 03/15/2016 15:29:16
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03/15 19:03, , 33F
連positive control都很弱怎麼會懷疑是細胞問題?
03/15 19:03, 33F
因為我沒有圈gata，細胞累積圖整個很分散，死細胞無法bind到抗體，因此分母變大很多 ，分子不變，所以pick看起來就好像沒有shift ※ 編輯: tony51501 (27.247.39.155), 03/15/2016 23:46:11
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03/16 11:25, , 34F
有訊號即使%還是會看到shift
03/16 11:25, 34F
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03/16 11:28, , 35F
%"少" 漏字，你的圖看起來比較像是沒訊號不是%少
03/16 11:28, 35F
我positive的圖沒有放上來，是有shift一點但不明顯 ※ 編輯: tony51501 (39.12.90.126), 03/17/2016 09:52:56
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