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[求救] PCR一直smear

看板Biotech (生命科學)作者 (ccclaz)時間9年前 (2016/04/29 09:50), 9年前編輯推噓3(3推 0噓 36→)
留言39則, 8人參與, 最新討論串1/1
<補充> 先前長官給我一個10K plasmid跟一對完全互補的primer 要我做mutagenesis 直接P出一個完整的plasmid 先列PCR的條件 10K plasmid 2 ul 10uM primer 1 ul Phusion pol. 0.5 ul 2.5mM dNTP 4 ul 5x buffer 10 ul 10% DMSO 15 ul ddH2O 17.5 ul ---------------------- Total 50 ul 因為primer彼此完全互補(迫於無奈不能改QQ) 一般PCR只會產生primer dimer 我使用two-stage PCR來跑 98C 30sec 98C 10sec┐ 50C 30sec│5 cycles 72C 3min ┘ Mix 98C 10sec┐ 50C 30sec│30 cycles 72C 3min ┘ 72C 10min 但目前只能跑出一堆smear http://i.imgur.com/NNVjpwZ.png
上圖lane2~lane8為跑gradient 60C~50C的結果 現在我試過的條件如下 1.primer預測Tm為50 跑gradient50~60皆smear 2.Plasmid約10K 測試過20ng和2ng皆smear 3.primer測試過0.2uM 0.02uM皆smear 4.Taq測試過減半用量皆smear 5.cycle數降低為3+25皆smear 想請問還有什麼方法可以嘗試 感謝大家 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 125.227.239.187 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1461894611.A.5F2.html
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04/29 09:55, , 1F
真不能換 primer? primer長度多長？可有再延長設計的可能？
04/29 09:55, 1F
27個mer 我只是個菜鳥助理 現階段的處境就只能先試條件
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04/29 09:56, , 2F
然後，10K 產物用 Taq? 有一定程度的 mutation 耶。
04/29 09:56, 2F
Pusion polymerase其實不算Taq 我只是怕有人沒聽過 那我改一下好了
推
04/29 11:29, , 3F
不曉得你有沒有試過DMSO？
04/29 11:29, 3F
有喔
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04/29 11:30, , 4F
抱歉，漏看條件了，原來已經加了
04/29 11:30, 4F
推
04/29 12:13, , 5F
如果是Phusion做10k應該沒有問題，我認識的Phusion不是Taq
04/29 12:13, 5F
你是對的
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04/29 12:14, , 6F
template做別的PCR能做出東西嗎？搞不好根本壞了
04/29 12:14, 6F
沒試過P其他東西 那但我有自己重新轉殖抽plasmid 新舊結果一樣
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04/29 12:15, , 7F
primer TM可否再拉高？
04/29 12:15, 7F
嗯 我試試
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04/29 16:47, , 8F
完全互補又不能改的primer好像早期stratagene的Quikchange
04/29 16:47, 8F
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04/29 20:19, , 9F
phusion改版過喔 primer試0.5uM看看 然後我會把single
04/29 20:19, 9F
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04/29 20:19, , 10F
side再拉到10 cycles
04/29 20:19, 10F
所以你覺得要提高primer量? 另外first stage增加cycle數不會像用PCR product當template一樣非常容易smear嗎? 雖然我目前的狀況也很像這樣orz
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04/29 21:30, , 11F
你的 template 10K 然後你要從上面 P 多大的片段？
04/29 21:30, 11F
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04/29 21:31, , 12F
Phusion 我通常超過 3K 的都用 1 kb/40sec 去做。
04/29 21:31, 12F
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04/29 21:32, , 13F
我看你來你這個 smear 技不向 template DNA 也不像做
04/29 21:32, 13F
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04/29 21:32, , 14F
不完整的 amplicon...... 可以給 marker 的大小嗎？
04/29 21:32, 14F
sorry我講的不夠清楚 <補充> 先前長官給我一個10K plasmid跟一對完全互補的primer 要我做mutagenesis 直接P出一個完整的plasmid 我是用1 kb/15sec來做的 另外下面是我用的ladder http://i.imgur.com/Y7cyrbZ.jpg
※ 編輯: ccclaz (118.167.200.167), 04/29/2016 23:06:12
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04/29 23:19, , 15F
我覺得你沒說清楚是site-direct,是很大的誤導,
04/29 23:19, 15F
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04/29 23:22, , 16F
出問題的點已不只是pcr條件,連要mutation的設計也要存疑
04/29 23:22, 16F
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04/29 23:23, , 17F
phusion有出mutagenesis的kit,可以照它protocol修改一下
04/29 23:23, 17F
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04/29 23:26, , 18F
追根探討,上面的人得讓你多了解細節,才能更快解決問題
04/29 23:26, 18F
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04/29 23:29, , 19F
補充下,phusion已不用完全配對了,所以才說上面的人要費心
04/29 23:29, 19F
推
04/29 23:39, , 20F
試試看 68℃ 1kb/30sec 或是反應液陪完再多加0.5ul taq
04/29 23:39, 20F
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04/30 01:54, , 21F
我確定一下，你的 primer Tm 是照 Phusion 的算法算的?
04/30 01:54, 21F
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04/30 01:55, , 22F
Phusion 的 Tm 跟普通 primer 在用的不一樣，然後請改
04/30 01:55, 22F
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04/30 01:56, , 23F
用 1 kb/40 sec 試試看。
04/30 01:56, 23F
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04/30 01:59, , 24F
另外，用完全互補的 primer 做 SD mutagenesis 是否搞
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04/30 02:00, , 25F
錯了什麼？怎麼跟我印象中的做法不一樣？
04/30 02:00, 25F
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04/30 02:52, , 26F
推薦這篇 #1EmunDcy 改方法再定一個primer但是簡單很多
04/30 02:52, 26F
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04/30 13:32, , 27F
現在做 mutation 不需要用到 two-step 了啊。而 primers 互
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04/30 13:34, , 28F
補是常用方法。另外，你的 mutation 往各自的 3' 端會不會
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04/30 13:35, , 29F
有非常高的G/C比例，也要考慮一下它們的作用。然後，跑膠時
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04/30 13:36, , 30F
最好加個對照組：原plasmid和切過一刀的等等。
04/30 13:36, 30F
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04/30 21:13, , 31F
最早期SD的stratagene protocol就建議用完全互補阿
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04/30 21:17, , 32F
x兄可以看一下Quikchange manual
04/30 21:17, 32F
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04/30 21:20, , 33F
SD就是要省掉ligation步驟,還加ligase就可惜這設計了
04/30 21:20, 33F
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04/30 21:47, , 34F
喔喔原來如此！但這樣我有個疑問，在PCR結束後加一個緩
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04/30 21:47, , 35F
慢降溫的 hybridization 步驟會不會比較好？
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04/30 21:48, , 36F
補充，94 C 3 分鐘後再緩慢降溫。
04/30 21:48, 36F
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04/30 23:15, , 37F
也許每個case不同，但個人經驗中Quickchange跟inv-PCR
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04/30 23:16, , 38F
Quickchange做了快一個月沒出來, PCR+PNK+Ligase一次就成功
04/30 23:16, 38F
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04/30 23:18, , 39F
不過這是個人經驗，僅供參考
04/30 23:18, 39F
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