[討論] ChIP assay實驗過程

看板Biotech (生命科學)作者phoebe1620 (Phoebe)時間9年前 (2016/05/01 22:33)推噓0(0推 0噓 0→)

留言0則, 0人參與討論串1/1

各位大大好~ 最近鑽研很多ChIP protocol也實際做過四次以上，IP下來的DNA最後都去跑PCR,但是只有一次PCR的結果有P出來而同次的IgG同樣也有p出來，另外每次實驗的input皆有P出，但是 IP和IgG(跟別人借kit用的)就只有一次有東西，這是跟著別人paper做的希望能做出一樣的結果，但之後克服了IgG沒有nonspecific binding之後，我的IP也沒有東西了，想跟各位高手討論討論~(我們家沒有買kit,有前人留下不怎麼清楚的protocol) 經過比對成功與不成功的實驗步驟的差異想請問以下過程是否真會影響到IP(抗體用1.5ug ,使用磁珠IP) 1.salmon sperm加的時間點成功:在preclear(30min)時(已dilute10x)已加入salmon sperm DNA(final為20ug/ml) 及PI 未成功:preclear同時加了PI和leupeptin,preclear完後才加入salmon去IP note:成功的那次因為有nonspecific binding的問題,之後的實驗改變salmon加的時機，也有增加prclear用的beads,解決非專一性結合，IP卻沒有東西，salmon sperm DNA會不會影響樣品與抗體的結合 2.IP buffer 成功:20mM Tris pH8,300mM NaCl,0.01%sds,1.1%triton 1mM EDTA 未成功:有用過成功的buffer，也有降成150mM NaCl去試 3.elute+de-crosslink條件成功:67度2hr+100度10min 未成功:65度1.5hr+100度5min note:有protocol使用磁珠的條件是未成功的那個，因為想縮短實驗時間因此之後都用第二個，第二個有方法有先確認過可以decrosslink,但不確定是否有elute下來外加sample都是用同一批，保存也沒超過一個月，我都不知道該不該相信有P出來的那次結果~實驗條件是一次動一兩個，有參考別人的protocol且為了讓步驟更好才決定動條件，有不夠詳細的地方再麻煩各位提出謝謝補充:會認為IP有成功是因為我同時p好幾組primer,就只有paper上的target有被p出來，其他則沒有，IgG也只有主要要看的target有被p出來，照理來說有nonspecific binding 的話其他組的IgG也應該會p到東西吧～但我先把它歸類在有nonspecific binding 的問題 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.72.46 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1462113207.A.C5E.html ※ 編輯: phoebe1620 (140.112.72.46), 05/02/2016 08:47:32 ※ 編輯: phoebe1620 (140.112.72.46), 05/02/2016 09:07:41