Re: 質譜在蛋白質結構研究上之應用

看板Biotech (生命科學)作者Elliot32 (good luck)時間20年前 (2004/10/12 22:50)推噓1(1推 0噓 0→)

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※ 引述《oplz (oplz)》之銘言： : 我是門外漢..這幾天看了一堆 structural biology 的 articles.. : 感覺有點消化不良.. 看到難得有專家在這趕緊問些問題! : 1. crystal biology 裡面的結晶多是在細胞內不存在的情況下結晶而成 : 要怎麼確定 in vitro 結出來的就和 cell 內的 protein structure 是一樣的? : 也就是我們怎麼知道解出來結構真的出現在細胞內? : 以 prion 為例, 一種 protein 確有可能有兩種以上的結構 : 我們怎麼知道我們拿到的穩定結構是對的那一個? : 如果確有可能拿到錯的結構機率有多大? : 能拿到結晶的 protein 裡面有幾成是可信為真的? 剛剛有點倉促，打的很亂，不知道看不看的懂基本上就如前一位版友說的，要去確定protein的結構在in vivo和in vitro 是否相同，以目前的技術來說是不可能的，不過我們可以根據該protein在in vivo 的enviroment，去決定在長晶時要添加什麼去幫助其結晶，舉例來說，一個ATPase，通常我們可能加入ADP、ATPγS、鎂離子，等去幫助其結晶，對某些protein來說，可以發現有添加的會長，而未添加的可能不會長或是長的很不好，另外，譬如一些membrane protein，通常都很難長晶，有些人會添加一些類似膜的LIPID分子去幫助其長晶，當然還有很多狀況，根據不同的protein，我們可以設計要以什麼樣的condition來長晶，這邊還是要強調，要在一個溫和穩定的環境下，有穩定的結構， protein才有機會長出晶體，當然還是會有一些特殊狀況，可能需要將protein放在4℃或是叫高溫的環境去長，另外加入一些substrate去長晶也是一個方法，譬如DNA binding protein 就加入DNA去長，長出晶體以後，解出結構，看看protein結構裡看不看得到DNA 另一方面也可以根據已知的funtion來跟得到的結構互相驗證，判斷其可信度有太多的學問，總歸一句結晶是一門藝術，有些時候還真的不能用哪些規則去度量 : 2. MS strategy 裡面, 可以知道 aa 的相對位置..但距離怎麼算? : 又用不同 chemical ragent 處理會不會改變構型? : 3. 有人說總有一天 protein structure 可以用電腦完全模擬出來 : 也就是說 protein folding 確實有一套依循的原理存在 : 只要找到這個公式就可解決問題, 你的想法? : 4. structural biology 的重要性在哪裡? 將來發展還剩下的空間跟扮演的角色? : 前景如何? (如果有人覺得這是問前途不理它亦可..) : 5. 你在袁小琀的lab 嗎? :) : ※ 引述《littlesky (littlesky)》之銘言： : : 介紹一下小弟最近在進行的一項研究 : : 結構生物學為目前生化研究上的一門顯學 : : 但台灣在這方面起步較為晚 : : 故慢世界潮流有一段時間 : : 目前在台灣在結構生物學上的發展 : : 除了中興其他幾乎集中於新竹以北 : : 其中儀器與技術將是目前結構生物學絕對的關鍵 : : 以目前研究蛋白質結構的兩大主流 : : crystallization and X ray diffraction : : 與 NMR 而言 : : 以 x ray diffraction 在解結構而言關鍵常在crystallization : : proetin crystallization 篩條件耗時耗工 : : 在某方面而言也相當耗錢 : : 目前除中研院生化所具有robot 可以大量節省篩條件的時間 : : 其他的少有實驗室有資本人力來作 : : 其另一重點為 x-ray diffraction 由於歷史悠久 : : 幾乎很多好找條件的protein (soluble , 穩定, 表現量大....等等等) : : 早已被解完 : : 現今的挑戰常在於一些 membrane protein, unstable protein... : : 由於 crystallization 所需 protein 量也大 , 更加深一些困難度 : : 就 NMR 而言 : : 目前高解析度的儀器極少 (台灣 800 Mz 才兩台) : : 且 protein 有一些size 的限制.. : : 在訊號的分析上也是相當的耗時耗工 : : 故科學家在這兩方之外又嘗試了一些方法來進行蛋白質結構的解析 : : EM (electro microscopy) and MS : : 利用 MS 解結構好處是其為 high throughput : : 與入門的條件較低 : : 其方法是將蛋白質進行利用特殊的化學試劑 : : 進行化學交連法 (chemical crosslinking) : : 此化學試劑可以專一性的將蛋白質特定的胺基酸以共價鍵結合 : : 處理完之後的蛋白質利用專一性的蛋白腜或是化學試劑將蛋白質水解 : : 再以質譜分析其片段將哪個幾號位置上的胺基酸與第幾號位置上的胺基酸交連 : : 就可以將蛋白質特定胺基酸的空間位置預測出來 : : 不同的種類長度的 cross linker 可以進行不同胺基酸的反應以增加可信度 : : 利用胺基酸的空間位置配合上 atomic modelling... : : 利用蛋白質二級結構的概念 (如熱力學立障效應) : : 即可極為初步的看出蛋白質三級甚至四級結構 : : 有人可能會 complain 這仍舊是有電腦預測 : : 但在二級結構上加入了 CD 的數據.. : : 三級甚至四級結構上加入了EM 的數據 : : 在擁有大量的實驗數據佐證上突破以往 x-ray 與 NMR 的 strategy 就產生了 : : 其優勢在於他不像 x-ray 需要有結晶, NMR 受到解析度與size的限制 : : 而且他需要量極少不像 x-ray 與 NMR 所需蛋白質量較高 : : 儀器上 LC-MS MS 與極高能量的 x-ray 光源, 超高解析度NMR動則上億比起來 : : 也是好的多 : : 故從 2000 年開始以質譜進行一些重要的蛋白質結構的解析越來越多LAB參與 : : 相關質譜應用於蛋白質 3D 結構上的軟體也被發展出來 : : 在 2003~2004 相關的 paper 突然暴增 : : 我在前一年碰 protein crystallization 後再有了single crystal後 : : 轉向研究 protein topology 上來才進入這項實驗 : : 目前除了我在中研院所接觸的lab以外還沒聽說過台灣的實驗室有人開始進行 : : 所以我有問題都得 e mail 去請教外國的專家.... : : 相關 reference : : Chemical cross-linking and mass spectrometry for mapping three-dimensional : : structures of proteins and protein complexes. : : J Mass Spectrom. 2003 Dec;38(12):1225-37. : : Chemical cross-linking and mass spectrometry for protein structural modeling. : : J Mol Biol. 2003 Aug 8;331(2):303-13. Review. : : 以上為介紹相當好的兩篇 : : A top-down approach to protein structure studies using chemical cross-linking : : and Fourier transform mass spectrometry. : : Eur J Mass Spectrom (Chichester, Eng). 2003;9(6):623-31 : : Probing three-dimensional structure of bovine serum albumin by chemical : : cross-linking and mass spectrometry. : : J Am Soc Mass Spectrom. 2004 Aug;15(8):1237-47 : : Mapping the topology and determination of a low-resolution three-dimensional : : structure of the calmodulin-melittin complex by chemical cross-linking and high-resolution FTICRMS: direct demonstration of multiple binding modes. : : Biochemistry. 2004 Apr 27;43(16):4703-15. : : ....... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 220.136.218.29