Re: [問題]GST fusion protein的問題

看板Biotech (生命科學)作者dorphilvet ( )時間19年前 (2006/04/20 16:20)推噓0(0推 0噓 0→)

留言0則, 0人參與討論串2/3 (看更多)

如果ligation後，transfermation 到 jm109或其他保菌的e.coli 你塗滿滿個plate後，隔天長出來的，一顆一顆的，你可以做colony PCR或養O/N 隔天用酵素切，如果有的話那個顆菌還不能叫做是single colony 你必需要把他確定有INSERT的COLONY挑一顆之後，再畫plate，畫成三重覆隔天再長的單一菌落再吊他養O/N後，抽plasmid去切酵素看看如果也是有，這才能確保你的菌只有這個一很純的plasmid 你再抽他的plasmid，再transfermation到會表現的細菌一樣塗滿再長，隔天會有一顆一顆的菌，你在這就可以直接挑因為你的plasmid很純，不會有fusion protein only的plasmid在裡面這樣你了解我的意思嗎? 因為我們之前送定序的結果，常常有雜band 所以老師之後要求我們做三重覆的colony 做了以後，品質會比較好你可以試試看，但只是參考 ※ 引述《churchfire (別小看我...)》之銘言： : 我在做GST-fusion protein的時候 : 我一開始養小量的試IPTG&溫度&時間 : 後來我在試時間的時候，IPGT濃度固定在0.4mM 溫度25度 : 0、3、6、9小時都收，在跑PAGE的時候其實看不怎麼出來我的蛋白有沒有大量表現 : 我的蛋白(26KD)加上GST(26KD)大約為52KD : 反觀GST在26KD的位置都有表現! : 同樣的條件去做western : 只有3hr的菌有看到微弱fusion protein的band 並有明顯的GST only的band : 請問這樣的話要怎麼解決呢?因為我後續要做GST pull down看interaction! : 大家有遇過這樣的問題嗎?我的蛋白推測是transcription factor : 會不會在產生的過程中，就回去bind在DNA上作用掉了? : ---------------------------------------------------------------------- : 同樣的我養1L的菌，IPTG 0.4mM 25度 6hr : 用GST˙Bind Kits(GST˙bind resin)來純化我的fusion protein : 收下來的做western, 同樣是微弱的fusion protein的band : 還有很明顯的GST only的band : 這樣的話,那我要如何才可以提高我的fusion protein?降低GST protein? : 希望各位學長姐可以給我點啟蒙!! : 謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.117.66