Re: [問題] 刮細胞要用cell lysis buffer(RIPA)或P …
※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: ※ 引述《euphorbia.bbs@ptt.cc (where to go)》之銘言：
: > 刮細胞時是應該加入RIPA(含protease inhibitor)再刮,還是先用PBS刮下來
: > 收集至離心管後,移去上清液,再加入RIPA(含protease inhibitor)?
: > 若先加入PBS來刮細胞,會不會因為尚未加入protease inhibitor於PBS,
: > 使得在刮細胞過程中,因為細胞破裂,導致protease釋出而分解破壞protein?
: 我想不出要先加PBS刮下來再換成RIPA的
: 而且可溶性的蛋白質在 PBS 下面也是會溶（一些）的
: 再製換成 RIPA, 原本溶在 PBS 中的不就損失了
: 會用到 PBS 的 應該是：
: 先把細胞用 trypsin 或 EDTA 打下來以後
: 離心 去上清液
: 加PBS wash
: 再離心 去上清液
: 加 RIPA
: 這樣的流程
一般跑western 最怕的就是 phospho-protein 的磷酸根被分解吧
只要用上述大家提的方法收lysate 之後凍到 -80
其餘的protein 都還挺強壯的 不太會degrade
若要跑phospho-protein
我們使用的是 4X sample loading dye 直接在 dish 刮細胞
首先去除 medium 接下用 ice-cold PBS wash
之後加 loading dye 刮除 , sonication , 加熱 直接就可以跑了
這種方法不能夠以 BCA or Bio-Rad 定量
所以就用數細胞的方法 每個dish 都種一樣多 再用同體積的 dye 去 lysis
loading也一樣 跑出來也就差不多囉
不然也可以染 actin 看怎樣來做調整
實驗室之前用RIPA 跑 phospho-protein 時有時無 很難搞
分不清是真的沒有還是收的過程就不見
用這方法就都沒問題了
供大家參考~
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