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[問題] 大片段產物的 PCR

看板Biotech (生命科學)作者 (曖昧不好不要曖昧)時間19年前 (2006/05/02 15:24), 編輯推噓3(3推 0噓 1→)
留言4則, 3人參與, 最新討論串1/4 (看更多)
我是參考某篇 paper 的作法 產物從500bp~3kbp 都有 所使用的enzyme是 ampliTaq Gold polymerase PCR program 95度 10min 95度 1min ___ 55度 2min |45cycles 72度 2min ___| 72度 7min 所使用的 primer 經過軟體測試 Tm值大概是 57~60 我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp) 結果長片段的(1kbp以上)出不來或是雜band(而且還沒期望出現的band) 短片段的有些有出來有些出不來(或有雜band) 看文章說大片段的可以考慮用 pfu 我就去弄來用用看 所使用的 program 是 95度 5min 95度 1min ___ 55度 2min |45cycles 72度 2min ___| 72度 7min 結果原本做出單一短片段的反應做出了雜 band(只挑一個出來對照) 大片段的產物都很奇怪(只有 8x~3xx bp) 因為我不太了解 pfu polymerase 的特性 不知道 program 是不是不適合 接下來可能考慮將 annealing 時間改短至 1min extension 時間拉長到 3min 想請問各位的是有用過 pfu 或做過大片段產物的人 你們所使用的 program (如果是用 pfu) 大概是怎樣的呢? 如果不是用 pfu...那是用什麼呢? 還有我是不是忽略了什麼可以調整的地方? 提醒我一下 謝謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.74.11
推
05/02 19:01, , 1F
不同的Taq主要區別在於是由不同物種而來
05/02 19:01, 1F
→
05/02 19:02, , 2F
一般DNAP合成DNA的速率大概30bp/sec，自己估算一下囉^^"
05/02 19:02, 2F
推
05/02 20:07, , 3F
pfu的反應時間說明書上有寫 你可以去找找看
05/02 20:07, 3F
推
05/03 00:39, , 4F
我們的做法比較保守，以taq1分做1000bp來算，你可以
05/03 00:39, 4F
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