Re: [問題] 大片段產物的 PCR
※ 引述《elderbear (曖昧不好不要曖昧)》之銘言：
: 我是參考某篇 paper 的作法
可以參閱一下，會比較快進入狀況。基礎PCR 作者： 張建裕:張建國/著
http://www.books.com.tw/exep/prod/booksfile.php?item=0010266910
: PCR program
: 95度 10min
^^-->時間長了些，很可能減低酵素活性，個人覺得3min以內，甚至可略
: 95度 1min ___
: 55度 2min |45cycles
: 72度 2min ___|
: 72度 7min
: 所使用的 primer 經過軟體測試 ，Tm值大概是 57~60
大致算法有兩種，一種是粗略的Tm=ax2+bx3 (a：A,T個數；b：G,C個數)
另一種為熱力學參數去算的，個人是用軟體為DNAStar
: 看文章說大片段的可以考慮用 pfu
pfu相當的powerful，國外品質比國內的好很多，也較穩定，價格也較貴
在點突變技術上相當好用，可參考http://www.stratagene.com/manuals/200518.pdf
之前曾用過粉暴力的用法，去點突變約3.5kb的質體
黏合溫度花了20分鐘拉梯度（實驗室窮沒梯度的PCR，為了省材料），
延伸溫度花了24分鐘，跑了20cycles，有做出成功產物。
: 你們所使用的 program (如果是用 pfu) 大概是怎樣的呢?
: 如果不是用 pfu...那是用什麼呢?
: 還有我是不是忽略了什麼可以調整的地方?
結論：延伸溫度可以先試試5min左右，再視情況調整，比較保險 :p
供參考囉～
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