Re: [問題] 大片段產物的 PCR
: 所使用的 primer 經過軟體測試
: Tm值大概是 57~60
: 我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp)
: 結果長片段的(1kbp以上)出不來或是雜band(而且還沒期望出現的band)
: 短片段的有些有出來有些出不來(或有雜band)
我覺得你可以試試把annealing溫度調得再低一點，
因為通常最適溫度會比預測溫度低五到十度
如果你的primer有secondary structure或GC含量高，
可以像前面有人建議的，用58度加dmso
: 看文章說大片段的可以考慮用 pfu
: 我就去弄來用用看
: 所使用的 program 是
: 95度 5min
: 95度 1min ___
: 55度 2min |45cycles
: 72度 2min ___|
: 72度 7min
: 結果原本做出單一短片段的反應做出了雜
pfu和一般的taq最大的差別是他有3'->5'profreading的功能，
而且他比較thermalstable，
文章建議大片段用pfu應該是因為片段越大越容易出錯，
用pfu可以增加擴增片段的正確率。
一般taq的效率約每30秒一kb，
taq因為有profreading，比較慢，約一分鐘1kb，
如果用pfu要做3kb的片段，最好把extension時間設在三分鐘以上
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推
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