Re: [問題] 請教各位先進E. coli表現與 SDS-page的 …
※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言：
: 各位先進，小弟初次接觸用E. coli表現蛋白！
: 我採用的是M15[pREP4]與pQE1，37℃，150rpm，1mMIPTG(最終)
: 我的蛋白質是20KDa
: 現在我是將誘導後(4hr)的菌液，取 100μL 離心 去上清液
: 直接再加入sample buffer (β-me)(有加熱處理)，然後直接跑SDS電泳。
: 可是在電泳圖上看不到我的產物位置 (我有對照組)
有可能沒有生成 不知你的protein對細菌有沒有傷害
induction條件下 細菌的生長會稍慢 可是如果很慢的話 可能就有問題
你用的vector (我沒查)應該不是secrete的吧
: 但我有觀察well到上有一層薄薄的白色沉澱物
: 我想問：
: 1. 那一層白色的東西是什麼？ 會是我的產物(都變成inclusion body)嗎？
應該細胞的碎片
: 2. inclusion body 加入sample buffer處理後直接跑膠片
: 這樣子會看到得band嗎？也就是sds可完全部破壞inclusion body？
可以, Sample buffer中的SDS 2-ME可以將inclusion body溶掉
: 3. M15[pREP4]與質體pQE1均會產生抑制子，1mM IPTG這樣子濃度夠嗎？
: 還是太多？(我是照著手冊上培養方式)。
這部分可能試了才知道 每個protein的狀態都不大一樣
: 4. 若萬一都是inclusion body，是否我要改變培養溫度(低溫培養)會比較好？
溫度 IPTG 時間 菌濃度 plasmid/host種類 都有paper提過
我個人沒有成功把inclusion body變成soluble protein的經驗
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