Re: [問題] 請教各位先進E. coli表現與 SDS-page的 …
※ 引述《wensing (潛力股)》之銘言：
: 各位先進，小弟初次接觸用E. coli表現蛋白！
: 我採用的是M15[pREP4]與pQE1，37℃，150rpm，1mMIPTG(最終)
: 我的蛋白質是20KDa
: 現在我是將誘導後(4hr)的菌液，取 100μL 離心 去上清液
: 直接再加入sample buffer (β-me)(有加熱處理)，然後直接跑SDS電泳。
: 可是在電泳圖上看不到我的產物位置 (我有對照組)
: 但我有觀察well到上有一層薄薄的白色沉澱物
: 我想問：
: 1. 那一層白色的東西是什麼？ 會是我的產物(都變成inclusion body)嗎？
: 2. inclusion body 加入sample buffer處理後直接跑膠片
: 這樣子會看到得band嗎？也就是sds可完全部破壞inclusion body？
: 3. M15[pREP4]與質體pQE1均會產生抑制子，1mM IPTG這樣子濃度夠嗎？
: 還是太多？(我是照著手冊上培養方式)。
: 4. 若萬一都是inclusion body，是否我要改變培養溫度(低溫培養)會比較好？
: 煩請各位先進指點一下！
: 謝謝！
分享一下我的經驗
表現蛋白的部份應該是都差不多
但是在跑膠時
我會先離心(把菌離下來)
然後加8M urea去破菌
(回溶菌泥後有可能澄清也有可能渾濁 視菌量而定)
加熱到90度 10至20分鐘 跑膠
可以看出有沒有表現
但是不能知道是否是inclusion body
白白的東西應該是菌的殘骸
你sample buffer中有什麼成分?
如果只是SDS應該不足以完全破壞inclusion body
(上面這句話是我據經驗推測 有錯請糾正 感謝~~^^")
問題3的話 因為我不熟 所以不好意思亂蓋 XD
形成inclusion body原因很多
你可以試試不同狀況
如: OD600=0.4 or 0.6 or 1 去induction
IPTG濃度: 1mM 0.5mM 或 0.1mM
induction時的溫度: 37度 30度 20度
induction時間: 4hr...等 通常配合溫度調整
我也是新手 歡迎再討論
祝你順利唷~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.99.119
討論串 (同標題文章)
以下文章回應了本文：
完整討論串 (本文為第 1 之 5 篇)：
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章