Re: [問題] RT-PCR for Full lenth cDNA
※ 引述《bluestanley (好想吃蘋果...)》之銘言：
: 最近要P約3000bps的一段full lenth cDNA
: 因為primer沒得選擇只能用ORF的頭尾兩段
: 廠商送來的Primer Tm值差了約5度左右 (61度&56度 G/C約50%)
: 但是一直P不出來 快要發瘋了
: 想請問一下各位高手 P大片段DNA時所用的condition是怎樣呢?
: 或者有什麼要注意的地方呢?
: 謝謝大家指教 ^^
第一個 PRIMER要注意你的TM可以試看看用58度~~
G/C越高 越難P阿...還有你的3000bp的片段..
extension時間需要看你的Taq能力唷...普通的taq差不多也要120秒..
還有建議你!!這麼長的片段最好用好點的Taq 有proofreading的比較好..
不然錯誤很多的..定序回來會想哭吧!!
在不然如果你知道sequence的話..可以分前後段P..然後中間至少有100bp
overlapping 前後在接起來也可以得到全長!!
另外..一開始95度的分開兩股時間久.一點..片段好長!!!
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