Re: [問題] western blot 壓片的問題..

看板Biotech (生命科學)作者threestars (等待)時間19年前 (2006/07/21 13:51)推噓6(6推 0噓 4→)

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※ 引述《linker0726 (試著獨立)》之銘言： : ※ 引述《threestars (等待)》之銘言： : : 最近一直在押 ERK : : 你問的是protein的ERK1/2 還是phospho-ERK : : ERK量比較少本來是要壓久一點但20分鐘好像太久了 : : 你的ECL有稀釋嗎？ : : ERK 1：1000算滿濃的如果還出不來你可能要檢查一下是不是1抗或2抗壞掉 : : 抗體加入blocking buffer時 buffer溫度太高也不行 : : 如果是phospho-ERK 又比ERK弱 : : 我之前ERK和phospho-ERK 都用Santa Cruz : : ERK還OK phospho-ERK有夠糟糕壓了兩個月看的到band : : 但雜band一堆要不就是背景直很髒 : : 就像之前版友講的一樣狀況聖誕牌很糟糕 : : 跟老闆講又不太相信一直叫我試條件 : : 直到有其他老師跟他講說聖誕牌的會這樣他才相信 : : （好像是跟抗體不同批號有時候會出現特好或特壞的狀況） : : 最近換cell signaling 一下就出來拉漂漂亮亮 : 嗯嗯...其實我是新手..這是第二次自己跑western blot.. : 請問一些很基本的問題..我怕我是不是記錯了... : ERK還是phospho-ERK的訊號哪個比較強阿...我有點搞混了...只記得壓第一片時螢光很 : 明顯.壓了一秒BAND就很漂亮了..我記得這個是ERK吧..(也就是說我第一篇文打錯了..) : 應該是phospho-ERK壓不出來 (這個比較難出來???) : 另外.昨天有跟老師討論，他說有可能是我加2抗的時候，用MILK當稀釋關係... : 可是之前學長姐說加MILK會讓背景比較乾淨... : 於是我昨天跑今天壓了一片..可是不用MILK稀釋2抗..改用PBS 1X稀釋... : 是有跑出點東西了..但雜BAND還滿多的...還跑出來不是預期的BAND Orz : 等會再問看看我們家是不是用聖誕牌的 = = : 好像是...不過在確定一次 : 因為之前有換過一次抗體..但壓出來...band爆多的= = 幾乎每個不同的kD都跑出來.. : 專一性有點問題..就退掉了..所以現在我也不知道是用什麼牌子的 : 先在問看看囉... : 還有..用PBS會不會干擾phospho-ERK阿? 都有磷酸.... : 你都用什麼稀釋阿?? PBS應該不會干擾用PBST效果很OK 稀釋抗體我用blocking buffer 也就是10% 安佳脫脂奶粉(好像安佳的效果最好)溶在HBS buffer 我也用過實驗用BSA/PBST(PBS+Tween20) 也是10% 效果更好不過實驗用BSA 很貴所以我比較少用 (TBST 我沒試過不過隔壁實驗室的說加了Tris-base後怪怪的所以我就沒有用了) 之前有一段時間用5% 也是OK phospho-ERK 訊號弱很多最好能有control 來確定是實驗出錯(操作或試劑問題)還是本身實驗就沒有磷酸化的結果換了 cell signaling 我真的覺得抗體本身的品質是影響最大的雖然Santa Cruz便宜很多但data出不來結果浪費更多其他的regent 也浪費時間如果聖誕牌的抗體很糟糕你可以去跟弘晉抱怨要求可不可以換不同批號的抗體不過要填很多問題給Snanta Cruz原廠還有附上做不出來的照片或問題很多的data 大約兩三個禮拜就會有新抗體過來了 -- 如果活在世上只是扮演著大家所期望的自己那扮演好了又怎樣不如靜靜的讓自己消失吧總是多餘的存在只是種荒謬的錯誤 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.164.160.73