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[問題] Lipofectamine 2000

看板Biotech (生命科學)作者 (Apoptosis)時間19年前 (2007/02/13 15:59), 編輯推噓11(11推 0噓 5→)
留言16則, 8人參與, 最新討論串1/5 (看更多)
我查了精華區了，我transfect的時候照說明說書上的， cell confluency ~ 90-95% 6-well tray: DNA 3ug, Lipofectamine 4ul, 用的medium 是 Opti-MEM， 隔天看，細胞是沒有死很多，可是因為我是用GFP-tagged的， 在顯微鏡下，可以看到只有大概20%有GFP signal... 我只有incubate 24 hrs at 37C， 不過expression 應該24小時就夠了吧？！ 試了幾次，最好的也只有50% efficiency... 有用過的版友都是一用就達到說明書上的 80-90% transfection efficiency 嘛？ 所以想請教一下，是我忘了注意什麼重要的細節嘛？ 順便想請問一下，如果DNA放太多，會不會造成細胞怪怪的阿？ 因為我看有GFP signal 的細胞，nucleus 都是 weird shape， 正常的細胞核都沒有GFP signal...@@.. 這讓我很confused, 不知道那些有GFP signal 的細胞是真的有成功transfected的嗎？ 先謝謝了。 -- 　　夢想和現實是有距離的。 　　一切都將重新開始.... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 64.180.57.97
推
02/13 16:06, , 1F
看你是什麼cell,不同Cell line的effeciency會差很多喔~
02/13 16:06, 1F
推
02/14 01:16, , 2F
慢慢練囉...我也是一直進步.但是還是沒到說明書上的值
02/14 01:16, 2F
推
02/14 01:33, , 3F
DNA 對 Lipo 的 ratio 很重要....我們平常用的比例 1:4
02/14 01:33, 3F
→
02/14 01:34, , 4F
妳可以考慮看看這個比例......有進去的話24小時足夠看到你要的
02/14 01:34, 4F
推
02/14 22:52, , 5F
1:4?請問一下你們計量DNA的單位是什麼?
02/14 22:52, 5F
推
02/14 23:01, , 6F
如果你欲表現的產物較大.使可以考慮延長表現的時間.
02/14 23:01, 6F
推
02/15 04:24, , 7F
1 ug DNA 對 4 ul lipo 最多一個well 不超過 2 ug DNA
02/15 04:24, 7F
推
02/15 12:21, , 8F
我是用HeLa和vero，感覺HeLa的efficiency比較好。
02/15 12:21, 8F
→
02/15 12:23, , 9F
我最近是的比例是3:4，看起來，我好像用太多了？
02/15 12:23, 9F
→
02/15 12:26, , 10F
DNA太多反而效果會不好嘛？
02/15 12:26, 10F
推
02/15 12:28, , 11F
很感謝大家的熱心回答，我再試試看。
02/15 12:28, 11F
推
02/15 23:34, , 12F
80-90%~原廠說明書看看就好~有PAPER證明較重要
02/15 23:34, 12F
推
02/16 02:20, , 13F
DNA 太多當然不好....效率不升反降喔...但是這個東西有時候不ꐠ
02/16 02:20, 13F
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02/16 02:20, , 14F
一樣的plasmid 　跟不同的細胞條件不會一樣
02/16 02:20, 14F
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02/16 02:21, , 15F
Hela 1:4 肯定夠了
02/16 02:21, 15F
推
03/30 14:29, , 16F
我用過293T cell line,效果還不錯 DNA的確不能加太多
03/30 14:29, 16F
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