Re: [問題] Lipofectamine 2000
感謝各位板友的熱心回答，感動。
我目前是用Lipofectamine 2000 想把pSuper 送進細胞做knock-down，
我學長之前是用RNA duplex，一樣是用Lipofectamine 2000，
所以看了產品說明之後，很好奇為什麼一樣是用Lipo 2000，
送DNA 和送RNA 所需的cell density 不一樣，
之前a大說用Lipo2000 送DNA很毒，那送RNA不會嘛？
Lipo2000 送DNA 和 RNA 的毒性不一樣喔？
有點不懂說... 其實這就是我主要好奇的地方啦！
不過我家的Lipo2000 是才剛新買的，
也不好馬上又買另一種用啦！所以只有繼續用Lipo2000送我的pSuper，
不過我的pSuper沒有mammalian selection marker，
所以transfect進去後，很難知道到底transfection efficiency 是多少，
目前只能用ImageJ 一個一個量signal intensity，
看有沒有減少，之前有說用WB，但是我學長試過，
我們的Ab做WB效果很不好，需要大量的蛋白質，
才能在WB顯現出來，做immunostaining的dilution也要到1:50，
不像平常的Ab，1:100-1:500之間都okay。
所以才想問問有沒有其他辦法的。
之前有看到一篇paper，它也沒有用drug selection，
transfect 隔天就把cell dilute 到lower density，
然後再放個2-4 days，用WB測出來的k/d是50-70%。
結果這兩天我用GFP-tagged protein試試看，
看看這樣做transfection efficiency 是多少，
(用GFP-tagged 是因為比較好觀察)
結果把細胞dilute 到lower density 隔天，
發現死好多喔！
反而transfect 的隔天，就是split cells 之前，
死的細胞只有一點點，dilute 之後卻死一堆。
不過這些到時候用顯微鏡看就知道存活的有多少是transfected 成功的，
我比較煩惱的是-- 要是我用pSuper 下去，又沒有drug selection，
到時後我怎知道存活的有沒有k/d 成功，efficiency 是多少，
又，哪些cells 是k/d 成功的。
苦惱阿～
對了，想問一下，我的pSuper 其他實驗室給的，
他們用RT-PCR 測是：transfect 三天後，mRNA有明顯減少，
這樣的話，蛋白質也是三天嘛？還是要比三天長？
之前有板友說看蛋白質的turn over 是多久，
可是我不知道我的蛋白質是多久，
在沒有drug selection 的情況下，
不知道我的細胞要是放6-9天，
存活的會剩多少是有成功transfected 的。~~>.<~~
--
夢想和現實是有距離的。
一切都將重新開始....
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 64.180.57.97
※ 編輯: ad1980 來自: 64.180.57.97 (04/06 12:12)
※ 編輯: ad1980 來自: 64.180.57.97 (04/06 12:22)
討論串 (同標題文章)
Biotech 近期熱門文章
PTT職涯區 即時熱門文章
