Re: [討論] cloning
看板Biotech (生命科學)作者countonme (that's just me)時間18年前 (2008/03/26 18:03)推噓0(0推 0噓 0→)留言0則, 0人參與討論串6/6 (看更多)
: 1.就我個人經驗，PCR product做TA cloning時，
: 這樣的ligation成功機率非常高，
: 非常容易得到多且正確的colonies。
: 但其他的steaky end ligation很少有如此高的成功率。
: 所以你後來得到的colony數目不多實屬正常現象。
: 不過我也不知道為什麼TA ligation的效率會比
: 其他steaky end ligation來得高，
: 有沒有高手解答一下？
我認為TA效率高的原因可能是因為 TA ligation
只需T與A一個mer之間的碰撞即可，且TA又是雙氫鍵，鍵能亦比CG低
反觀像是RE digestion的steaky end多為四個mer
所以就機率與鍵量來說ligation效率應該會比較高
: 2.請問原po有沒有注意vector和insert之間的比例？
: 一般來說，
: insert的量必須遠高過vector，
: 效率才會好。
: 不過重點是，
: 其實只長一顆也沒關係呀，
: 有中就好!!
: 3.檢驗pEGFP-N1有無被切開，
: 可以跑膠比較切以前和切以後的plasmid大小，
: 雖然被切下的部分只有40-50bp應該看不到，
: 但是如果環形的plasmid有被切成線形，
: 跑膠後大小會和原本的環形差很多。
: 4.不知道你有沒有做vector only和insert only的control?
※ 編輯: countonme 來自: 140.114.100.189 (03/26 18:05)
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