Re: [求救] cloning 失敗好多次就是接不起來...

看板Biotech (生命科學)作者ROKEE ( Beanazai)時間17年前 (2008/03/27 10:39)推噓3(3推 0噓 3→)

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※ 引述《pop6234 (表面的和平)》之銘言： : 我的insert大概是1400bp : vector是pAS2-1 (Clontech) : 切單刀 : 所以有用CIP處理vector : 切完酵素之後跑電泳切膠 : gel extraction之後 : 再做ligation : 16度C overnight : 因為我的insert量很少 : 所以我insert跟vector的ligation比例用 : 3:1 3:0.5 5:0.5 : 還有做vector的(切完酵素之後再ligation) : 可是 : transform之後 : 盤上一顆也沒長 : vector only的也沒長... : 本來老闆覺得是我技術不好 : transform有問題 : 所以我上次有多做一組沒有切過酵素的vector : 那次就那盤沒切接過的有長而已那這組positive control長出來的colony數有合格嗎? : 如果說是我ligation的比例不好之類的 : 我都可以接受 : 可是 : 連vector only的都沒長 : 讓我真的不知道該怎麼改我的實驗 : 想請教大家連vector only 的都沒長有可能是什麼原因? vector是人家給的吧? 凡是自己沒有確認過的東西都先別相信是真的 : buffer之類的都是公用的 : 別人的clone都有長 : 就我的長不出來... 這問題常出現在剛入實驗室的新人身上先不就接進去的這片段是否有細胞毒性 (就算是要順利表現活性的機率也超低,但我就衰到碰過) 小弟我覺得要先檢討你的transformation efficiency 這包括了compotent cell置備 (貴實驗室若是$$多買現成heat shock的效果也絕不會比用eletroporation的好) 另外送入DNA的質與量是否足夠我個人覺得，拿不到clone多和個人手法有關....... -- 蓋圖書館超痛苦 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.34.28.233

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