Re: [求救]primer design之我是新手已刪文

看板Biotech (生命科學)作者jazzdevil (Hola)時間17年前 (2008/08/04 22:34)推噓1(1推 0噓 1→)

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我是用ABI primer express 3.0做設計目前我也是覺得照條件跑出來的沒這麼滿意後來也有把amplicon調高到200-250 bp 其它的大多照大家建議的方式做微調整可是看來看去都覺得有一好沒兩好假設 Forward裡面 cross dimers GC鍵結一條;AT兩條;AT(虛線)一條 Reverse: GC鍵結X2 ; ATx1 。 Self dimers: AT x2; CGx2 cross dimers: GCx1; ATx2 因為看來看去如果沒hairpin的也許就有其它的dimers好幾條真不知怎麼挑選起...虛線的表示鍵結較弱嗎? 請大家多多指教。 ※ 引述《meiosisLin (吽爸)》之銘言： : 講一下我的經驗好了 : 之前做過就有在做primer design的工作 : 最近也正好再接觸Real time PCR 的部分 : 一般的primer design注意兩件事情 : 1.序列盡量保持亂數，ATCG通通都成亂數排列 : 2.CG%要控制好，盡量CG:AT=1:1 : 當然如果是clone等狀況就另當別論.......... : 而在 Realtime 部分 : 我目前用的是ABI的機器 SYBR Green的系統 : primer design的部分我交給primer expression去設計 : 在我所選定的特定範圍中做（等等詳述） : 只要是用ABI的機器，理論上都有『primer expressoin』這套軟體可用 : 如果是Roche 的話我就不熟了....... : 以下是軟體的部分設定值 : Tm值設在58~60℃(原廠設定) : product size 50-150 bp(原廠設定) 之前問廠商最多可以到250bp : CG% 30%-80%(原廠設定) 不過考慮二級結構和Tm等問題我設定在30%-50%最多60% : primer length 個人習慣設定在 20bp上下...不超過30bp : primer 3' GC不要超過2 bp (原廠設定) 最好也都不要有CG : G repeats 不要超過3 bp : Probe部分不寫.... : 另外SYBR Green部分要特別注意Dimer 的問題 : 所以一對primer設計出來後要特別去注意一下 : 對本身和對另一條primer有無dimer的產生... : 最後........ : 序列選擇上...只要是許可狀況下 : 我都會選擇有跨過junation的部分來設計 : 這樣可以避免gemone DNA 的干擾...... : 以上...大概是這樣 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 124.8.29.192